液体注入硅胶作为一种抗生物膜的医疗材料外文翻译资料

 2022-12-30 11:09:36

液体注入硅胶作为一种抗生物膜的医疗材料

原文作者：Noah MacCallum, Caitlin Howell, Philseok Kim, Derek Sun, Ronn Friedlander, Jonathan Ranisau, Onye Ahanotu, Jennifer J. Lin, Alex Vena, Benjamin Hatton, Tak-Sing Wong, and Joanna Aizenberg.

单位：美国马萨诸塞州剑桥市哈佛大学，工程与应用科学学院，化学与化学生物学系，威斯生物启发工程研究所.

摘要：抗生素会加剧对多药和全药耐药性传染性生物的增加，因此，迫切需要不使用抗生素的预防感染策略。该领域的重要目标是抑制细菌附着以及随后在医疗设备（例如导管）上形成生物膜。在这里，我们将不结垢，注入润滑剂的光滑聚合物描述为基于硅油注入的聚二甲基硅氧烷（iPDMS）的概念证明医学材料。平面和管状几何形状的有机硅基材可以注入无毒的有机硅油，以形成稳定，光滑的界面，表现出极低的细菌粘附力并防止生物膜的形成。通过未经处理的PDMS和iPDMS管对铜绿假单胞菌的流式培养分析表明，iPDMS上生物膜形成至少减少了一个数量级，而温和的水冲洗后，iPDMS上几乎没有生物膜形成。iPDMS材料可以作为其他聚合物的涂层，也可以通过将硅树脂管简单地浸入硅油中来制备，并且与传统的灭菌方法兼容。作为演示，我们显示了硅胶涂层聚氨酯导管的制备以及导管表面上大肠埃希菌和表皮葡萄球菌生物膜形成的显着减少。这项工作代表了迈向简单有效的方法的重要第一步，该方法可防止细菌粘附在用于医疗器械的多种材料上。

关键词：防污材料，生物膜防护，光滑表面，医院感染，医疗材料

前言

经过数十亿年的进化，细菌已经形成了抵抗物理和化学攻击的生存机制[1、2]。促进细菌生存的一个关键机制是生物膜形成现象，浮游生物附着在表面并形成牢固附着，抗剪切，基质嵌入的多细胞群落[3]。生物膜可以在多种营养和流量条件下几乎在任何表面上形成，一旦形成，就表现出卓越的抗去除能力[4,5]。

微生物膜的形成会引起严重的问题，尤其是在临床环境中。NIH估计，生物膜占人体微生物感染的80％以上[6]。致病性生物膜可抵抗天然免疫系统和抗生素的破坏 [2,7,8] 并导致主人严重感染[1,9-11]。此外，细菌病原体正对我们的疗法越来越不敏感，使致病性生物膜的附加耐药性甚至更加危险。尤其是，革兰氏阴性铜绿假单胞菌在全世界引起的医院(医院获得性)感染中占10-15%[12,13]，具有很高的内在耐药性并表现出几乎所有已知的对新疗法具有适应性抵抗的机制。14 面临类似挑战的其他临床相关病原体包括大肠杆菌[15]和葡萄球菌表皮 [16]这些生物也在本文中进行了研究。因此，防止细菌粘附的“物理的”，无细胞毒性的方法具有重要意义，因为它可以避免选择这些生物体的耐药性的压力[17-19]。生物膜的形成与几乎所有医院感染都有因果关系，以一种简单和可持续的方式减少医疗材料表面的细菌附着对全世界的卫生保健系统具有巨大的重要性。例如，尿路感染（UTI）占所有医院感染的40％，[20,21] 其中11％是由铜绿假单胞菌引起的[22]，抑制导管材料上生物膜的生长可以大大改善这种情况。

以前的材料研究[23]解决细菌结垢问题的重点是抗菌涂层以及固体材料的化学和结构改性。抗生素[24-26]和基于金属离子[27,28]方法已显示出在减少生物膜生长和感染方面取得了一些成功，但是这些方法破坏了细菌种群，并加速了耐全药病原体的出现[29]。疏水性和亲水性材料在细菌粘附中的作用已被广泛研究[30-33]。与亲水性表面相比，疏水性表面通常会引起更大的初始附着，但沉降生物更容易脱离[30,34,35]。表面形貌对促进[36]和防止[37-40]生物物种的附着也很重要，亚纳米级光滑的钛表面已被证明可以减少细菌的附着[41,42]。但是，这些方法仅取得了有限的成功，并且未能生产出高效，长期的抗生物污垢材料。特别是医用导管的抗菌涂层提出了极大的挑战，因为内表面和外表面通常都需要结构化或功能化，并且进入这些表面受到阻碍且成问题。

微结构胃肠道的内壁涂有一层厚厚的液体粘液层，该粘液层可保护并保护下面的组织免受细菌种群的定殖[2]。这为具有表面液层的新型抗污垢材料提供了灵感，该表面液层由于毛细作用力和化学亲合力而固定在粗糙的固体上，并产生低粘附力的界面。在聚四氟乙烯(PTFE) [44]为基础的系统中，以及最近在氟凝胶[45]和血管化聚合物网络[46]中，这种生物激发的光滑液体注入多孔表面(SLIPS)显示出了良好的抗菌性能。设计具有稳定且可连续补充的润滑剂层的光滑表面，特别是对于医疗导管和与导管相关的材料（例如聚氨酯和硅树脂）和其他流动暴露的医疗材料（已知细菌数小时内会在其上附着并形成生物膜），这将是有益的[47]。我们认为，将聚二甲基硅氧烷（PDMS）之类的硅树脂与无毒且兼容的溶剂相结合，以形成一种润滑的液体覆盖层，以抵抗细菌附着在硅基或涂覆有硅酮的医疗材料上，可能会成为一种非常实用的方法，。

与最近报道的依赖自定义聚合物的注入聚合物不同[ 48]， PDMS是医疗领域中广泛使用的无毒材料。它具有生物相容性，柔韧性，并且在灌注大量润滑液时会变得很滑[49,50]。润滑剂的灌注/溶胀可提供扩散油的储存，并有助于在存在连续剪切力的情况下确保润滑剂层的寿命。我们预计，最初的生物膜形成将受到在硅酮上形成的极其光滑，光滑和流动的液体表面的抑制。此外，我们期望即使在注入润滑剂的PDMS（iPDMS）表面上初步形成生物膜，由于生物膜与液体界面的粘附力降低，在高剪切流中也很容易将其冲走。本文中，我们介绍了iPDMS或iPDMS涂层管，它是一种有效的，无抗生素，无生物污染的材料，可以进一步开发用于留置导管和其他医疗设备中。

1.材料与方法

1.1. 扁平硅胶样品制备。制备平坦的有机硅样品（Dow Sylgard 184，PDMS）以进行接触和滑移角表征。将预聚物与固化剂以10：1的比例混合，在双离心混合器中混合，倒入平皿的底部，并在真空室中脱气1 h。在将样品从培养皿上剥离之前，将其在70°C下固化4小时。对照样品未经进一步处理即可使用。将固化后的PDMS浸泡在5 cSt硅油(Sigma-Aldrich)中过夜，制备浸液硅胶(iPDMS)样品。

1.2. 硅胶管样品制备。将内径为6.4 mm的Masterflex品牌过氧化物固化的有机硅管（Cole Parmer，Masterflex L / S17）浸入5 cSt硅油中过夜（约16小时），以制备用于抗污垢表征的iPDMS管样品。溶胀前，通过在121°C高压灭菌15分钟，对三个1 m的硅胶管进行灭菌。硅油通过Millipore 0.2mu;m过滤器单元进行无菌过滤。将管样品无菌转移到无菌硅油浴中，放置过夜。在使用前，使用相同的高压灭菌周期对对照管样品进行灭菌。

1.3. 硅胶涂层聚氨酯导管样品制备。首先用乙醇冲洗双腔聚氨酯导管（OD 0.16 mm）并干燥。为了牢固地附着硅树脂并防止iPDMS分层，涂上一层底漆(道康宁，Sylgard 1205底漆)，用它湿润的组织擦拭，在室温下养护2小时。底漆主要基于烯丙基三甲氧基硅烷，它形成了聚硅氧烷层的交联网络。固化底漆后，采用PDMS (Dow Sylgard 184)预聚体喷涂或浸渍涂层，在70℃下固化2小时。PDMS预聚物混合物的粘度为使用六甲基二硅氧烷基有机硅溶剂（顺滑，NOVOCS光泽有机硅溶剂）进行调节。然后将涂有硅氧烷的聚氨酯导管浸入5cSt硅油中过夜，以制备涂有iPDMS的聚氨酯导管样品（参见图1中的图S1）。为了使iPDMS涂层可视化，将Oil Red O（Sigma-Aldrich）染料与PDMS预聚物或有机硅溶剂预混合。使用与硅胶管样品相同的高压灭菌循环对所有处理过的导管样品进行灭菌。

1.4. 接触角表征。用测角仪(KSV仪器，CAM101)在平面硅树脂基板上测量接触角。将iPDMS样品垂直悬挂，然后放在吸水纸上以除去多余的润滑剂，然后再进行表征。对于每次静态接触角测量，将15mu;L去离子水滴放在基板表面，静态接触角是使用Young-Laplace曲线拟合获得的；在一个PDMS样品的不同区域重复此操作10次。使用一种带有20G钝针的精密注射器使水滴膨胀和收缩，对水滴进行成像和分析，分别获得前进和后退接触角。测量前进和后退接触角10次，取平均值，并相减，以获得接触角滞后值。

1.5. 滚动角表征。使用带有数字量角器的滑动平台来测量每个平坦的有机硅基板表面上20微升水滴的滑动角。至除去任何灰尘和其他污染物，我们用去离子水轻轻洗涤样品，然后风干。每次测量时，应缓慢增加角度，直到液滴开始沿表面滑动为止，此时观察到了滑动角度。在PDMS样品的不同区域重复此操作10次。

1.6. 粘合力测量。iPDMS的摩擦系数是根据ASTM标准D1894-14测量的。在注射泵(哈佛仪器, PHD ULTRA)上安装一个数字测力仪(Mark-10，系列4)，以150毫米/分钟的恒定速率，在一个6 7/8”times;6 7/8”iPDMS样品上拉动一个0.1公斤的抛光2.5”times;2.5”铝雪橇(McMaster-Carr, alloy 6061)，使之与样品之间的距离为2.5”。尼龙单丝（Trilene，最大承重为3.6 kg，平均直径为0.012英寸）用作拖缆。PDMS样品在硅油中浸泡16小时，然后用纺丝涂布机(专业涂层系统，纺丝涂层G3P-15)在1000转/分钟的转速下纺丝60秒，以确保所有测试的iPDMS样品的润滑油表层厚度一致。

1.7. 通过蒸发去除润滑剂。加速和通过将完全注入的iPMDS样品放入70°C的烤箱中，可以均匀去除润滑剂。实验前轻轻擦拭样品，以去除表面上多余的润滑剂。然后每天使用Mettler Toledo Xs205 DualRange分析天平采集样品质量，以测量蒸发引起的润滑剂损失。

1.8. 润滑剂补给特性。使用相差光学显微镜在低放大倍率下成像样品的表面，以观察表面液层的覆盖率。使用吸收性擦拭物将表面擦干并每小时成像24小时。提供的图像是平面iPDMS样本的典型示例。

1.9. 基于流量的生物膜实验。将表达GFP的铜绿假单胞菌PA14 在 Difco Miller LB 肉 汤 （ Becton ， Dickinson and Company）中培养过夜，在37℃下摇匀。然后将培养物1:100稀释到350毫升的LB肉汤中 0.2% (w/v)柠檬酸钠，放入500毫升的Erlenmeyer烧瓶中搅拌。无菌硅胶管一式三份安装：对于每个管，将入口浸没在接种的介质中，将中间部分安装在蠕动泵头中，将出口置于介质上方，以确保在已知剪切速率下，生物膜仅在管内形成。蠕动泵(Cole Parmer)能够以0.1 - 100.0 rpm的速度同时泵送三根管道，对于膨胀较大的管道，分别产生“低”(5.5 mL/min)和“高”(150 mL/min)的剪切速率(表1)。接种搅拌过的培养基后，当培养基开始从硅胶管的末端开始流动时，开始实验。

1.10. 静态生物膜实验。将表皮葡萄球菌（ATCC 12228）和大肠杆菌（ATCC 25922）放置在含有1.5％NaCl的胰蛋白酶大豆肉汤培养基中，密度约为107 细胞/ mL。然后将两端有盖子并涂有iPDMS的聚氨酯导管添加到培养皿中，在37℃下孵育48小时。取出后，导管碎片直接用结晶紫（CV）染色，其方式与下文所述流量实验的样品相同。

1.11. 结晶紫染色。在每个时间点，短暂停止流动，并从每个管上切下一个3.8厘米的管段。将切片垂直浸入装有自来水的闪烁小瓶中三遍。然后将试管垂直浸没在0.1％CV溶液中，并孵育15分钟。接下来，通过连续三次将短管样品浸入三个装满新鲜自来水的闪烁小瓶中，将非特异性染色剂从试管中清洗出来。最后，将干燥的氮气流轻轻地施加到内管表面，以干燥染色的生物膜。

为了分析染色和干燥的生物膜，将试管垂直固定在活页夹中，进行拍照，并用95％乙醇填充[51]。孵育15分钟后，使用移液器将乙醇轻轻混合，并在平底96孔板的一个孔中稀释2倍至终体积为200mu;L。使用读板仪测量每个孔在580 nm处的吸光度，并对高于3的任何值进行2倍稀释。将值相对于管的内周进行归一化，以考虑输注管和未处理管之间的表面积差异。

1.12. 共聚焦显微镜表征。在低剪

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