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具有纳米晶体的新型口服磷酸盐粘合剂粘结能力和pH效应
T.M.-H. Nguyen a,b, R.H. Muuml;ller b, M. Taupitz a, J. Schnorr a, B. Hamm a, S. Wagner a,
前言：高磷酸盐血症是导致终末期肾病患者发病率和死亡率的主要风险因素之一。随着高磷酸血症患者的数目不断增加，对新磷酸盐粘合剂的需求也不断增加。但副作用很大和目前可用的磷酸盐粘合剂很高的药丸负担是低顺应性和不受控制的血清磷酸盐水平的主要原因。因此，这项研究的目的是开发一种在整个胃肠（GI）pH范围内具有高磷酸盐结合能力的新型磷酸盐粘合剂。本文中的磷酸盐粘合剂C-PAM-10基于D-甘露糖包覆的纳米晶磁赤铁矿的新型磷酸盐粘合剂，被称为“铁基制剂”。它有可能获得一种表现出非常高的磷酸盐结合能力以及在相关pH范围内不依赖于pH的特性的磷酸盐结合产物。与通常使用的磷酸盐结合物司维拉姆碳酸盐相比，GI通道从pH1.2至pH7.5的模拟显示出2.5倍的磷酸盐结合能力。在pH值le;4.5时释放铁基磷酸盐结合剂的pH敏感性涂层的模拟仍然表现出非常高的磷酸盐结合能力以及非常低的铁释放，这可能降低体内铁相关的副作用。因此，C-PAM-10及其变体作为优异的磷酸盐结合物可能是非常有前途的候选物。
1．介绍
据估计世界人口的5-10％受慢性肾病（CKD）的影响，慢性肾病（CKD）可能进展至终末期肾病（ESRD）。排泄失败引起的磷稳态损失导致血清磷水平升高，这被称为高磷酸盐血症。对于ESRD患者，高磷血症是导致发病率和死亡率的主要风险因素之一（Bailie，2004; Block等，2004）。因此，治疗的有效方法是使药物中包含磷酸盐结合剂以减少摄入磷酸盐的吸收。研究表明，与未治疗的患者相比，使用处方磷酸盐结合剂的血液透析患者死亡率显著下降（Isakova等，2009; Lopes等，2012）。这些研究还促进了磷酸盐结合物具有促进生存益处的机制的可能性，这些机制无法控制血清磷（Isakova等，2009; Lopes等，2012）。但是，需要进一步调查充分解释这些影响。
尽管对新型磷酸盐粘结剂的需求正在增加，但理想的磷酸盐粘结剂仍然不存在。高剂量负荷（表1）和目前可用的磷酸盐结合剂的副作用是低顺应性和不受控制的血清磷酸盐水平的主要原因。钙基磷酸盐粘合剂曾经被用作标准疗法（Sprague，2007）。但是，这些药物与动脉钙化有关（Goodman等，2000; Guerin等，2000; London等，2003），因此不再主要用于治疗高磷酸盐血症。根据KDOQI（肾脏疾病结果质量倡议）骨病代谢和慢性肾病疾病的临床实践指南，含有非钙磷酸盐结合剂如盐酸司维拉姆或碳酸镧在透析患者中可减少血管或其他软组织钙化（National Kidney Foundation，2003）。司维拉姆盐酸盐（Renagel1，Genzyme）是与环氧氯丙烷交联的烯丙胺盐酸盐的不可吸收聚合物（Slatopolsky等，1999）。它具有很好的磷酸盐结合能力（Amin，2002; Goldsmith等人，2008），并且耐受性良好（Ketteler等人，2008）。碳酸镧（Fosrenol1，Shire plc）是另一种非磷酸钙粘合剂，与食物一起使用时耐受性良好（Freemont，2006），并表现出良好的磷酸结合能力。像盐酸司维拉姆一样，碳酸镧比钙基磷酸盐粘合剂贵得多。磷酸盐粘合剂的另一个问题是磷酸盐约束能力的pH依赖性。例如，碳酸钙（Calcichew1，Takeda Nycomed）在低pH值下表现出降低的磷酸盐结合能力（Sheikh等人，1989），盐酸司维拉姆在约pH7下显示最佳结合能力。在低于或高于此pH的值时， 结合的司维拉姆效果不好（Chertow等，1997; Rosenbaum等，1997）。
因此，本研究的目的是开发具有高磷酸盐结合能力的新型磷酸盐结合剂，其独立于胃肠道中的pH变化。这种创新的磷酸盐粘合剂被称为C-PAM-10，它基于D-甘露糖涂覆的磁赤铁矿（g-Fe2O3）。它属于新一类磷酸盐粘合剂，被称为“铁基制剂”。为了降低铁相关副作用的风险，另一个目标是实现低铁释放。
表格1 日常使用的常用磷酸盐粘合剂
活性物质和商品名 日剂量的范围
碳酸钙2500毫克（Calcichew Forte1） 3片
碳酸钙1250毫克（Calcichew1） 3-6片
碳酸钙1500毫克（Adcal1） 3-6片
盐酸司维拉姆800mg（Renagel1） 3-15片
司维拉姆碳酸盐800 mg（Renvela1） 3 -15片
碳酸镧500毫克（Fosrenol1） 3-6片
每日剂量仅用于比较，并不表示治疗等效（苏格兰医药联盟，2014年）
2．材料和方法
用于合成的材料：氯化铁（II）四水合物（FeCl2·4H2O），六水合氯化铁（III）（FeCl3·6H2 O），氢氧化钠，过氧化氢溶液（30％w / w），阿拉伯胶，磷酸二氢钠和聚山梨酯80（Tween1 80），购自SIGMA Aldrich（Steinheim，德国）。 Dmannose购自Acros Organics（New Jersey，USA），Spinnrad（德国Bad Segeberg）购买菊粉。泊洛沙姆407（Pluronic1F-127）是BASF（Ludwigshafen，德国）的礼物。用于分析的材料：磷酸二氢钠，七钼酸铵，硫酸（95.0-98.0％），酒石酸钾锑（III）水合物，盐酸羟胺，1,10-菲咯啉盐酸盐一水合物，冰醋酸，三水合乙酸钠，磷酸三钠IC 1000mg/L标准品和L-抗坏血酸购自SIGMA Aldrich（Steinheim，德国）。铁ICP标准溶液1000mg /L铁购自CARL ROTH（德国卡尔斯鲁厄）。用于所有实验的水用Milli-Q Gradient A10系统（Millipore，Merck KGaA，Darmstadt，德国）。
2.1． D-甘露糖涂覆的磁赤铁矿纳米颗粒的合成
作为口服磷酸盐结合剂的涂覆的磁赤铁矿纳米颗粒的合成基于专利DE102011112898A1（Wagner等，2013）。首先，将3.20克FeCl2·4H2 O和7.55克FeCl3·6H2O溶于50毫升含有25克D-甘露糖的D-甘露糖水溶液中。然后在剧烈搅拌下将溶解的混合物迅速加入到100mL的1.5M氢氧化钠溶液中并搅拌15分钟。然后加入3mL过氧化氢溶液（30％w / w）以将氧化铁颗粒氧化成磁赤铁矿。然后将混合物加热至60℃并再搅拌15分钟。为除去过量的D-甘露糖和未反应的水溶性盐，将形成的磁赤铁矿纳米颗粒通过使用分子量截留值为3.5kDa的分子多孔膜透析洗涤。透析在充满约4L Milli-Q水的水浴中进行。悬浮液透析7天，水每天更换三次。然后将悬浮液以3220g离心10分钟以除去大颗粒。含有磁赤铁矿纳米颗粒的上清液用于以下合成步骤。然后将3g菊糖和3g阿拉伯树胶作为药物赋形剂溶解。悬浮液在60℃烘箱中干燥过夜。用研钵和研杵研磨干产品后，得到细棕色粉末。
再使用聚山梨酯80或泊洛沙姆407作为额外的空间稳定剂进行生产。合成后，在透析步骤之前将这些稳定剂溶解在悬浮液中以形成聚山梨酸酯80（5％w / v）或泊洛沙姆407（1％w / v）浓度的溶液。空间稳定剂的添加应保持良好的分散状态并使其最小化聚合。针对含水聚山梨酯80（5％w / v）或泊洛沙姆407（1％w / v）溶液进行透析以防止洗去颗粒表面上的空间稳定层。
2.2．未结合磷酸盐的测定
根据DIN EN ISO 6878：2004-2009（D 11）进行体外测试以确定未结合量的磷酸根，并且基于Murphy和Riley（1962）的原始方法。加入500 mL空白1（Milli-Q水），样品或标准溶液溶液中，加入10mL抗坏血酸和20mL钼酸盐试剂并用Milli-Q水填充至1mL。之后将混合物在室温（RT）温育15分钟。还原的磷锑钼摩尔配合物用880nm处的空白样品进行蓝色和光度测定。未知的磷酸盐浓度用标准参考曲线确定。
2.3．释放铁的测定
向200mL空白（Milli-Q水），样品或标准溶液中加入100mL盐酸羟胺溶液10％（w / v）和700mL菲咯啉试剂。之后将混合物在室温（RT）温育15分钟。随后形成的深红色三（1,10-菲咯啉）铁（II）配合物用光度法测定在510nm处针对空白样品进行检测。未知的Fe3
浓度用标准参考曲线确定。所有的光度测量均使用UV VIS进行分光光度计Specord1 205（德国耶拿分析公司）。
2.4． 粒度的测定
为了确定透析过程中的团聚倾向，通过光子相关光谱学（PCS）测量透析和未透析的悬浮液的粒度。 为了减少测量期间的团聚，将聚山梨酸酯80加入到悬浮液中以形成5％w / v的聚山梨酯80溶液。 为了进行测量，样品必须稀释到1：200的稀释比率。为了避免稀释过程造成的结块，样品是用0.4％聚山梨酸酯80水溶液稀释。然后使用具有优化测量模式的Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments，Worcestershire，UK）测量样品， 平均粒径以z均值给出。
2.5． Zeta电位
通过Zetasizer Nano ZS（Malvern Instruments，Worcestershire，UK）测量颗粒的电泳迁移率。通过使用由Malvern Zetasizer软件分析的Helmholtz-Smoluchowski方程从电泳迁移率计算zeta;电位（ZP）。测量干燥产物（C PAM 10粉末）的ZP作为pH的函数。为了研究在生理GI pH范围内的涂布的磁赤铁矿颗粒的表面电荷，pH范围为1至8。
2.6．在pH 3.0,5.5和8.0时的磷酸盐结合能力
制备浓度为0.04molPO43-/ L的磷酸二氢钠一水溶液，然后调节pH至3.0,5.5和8.0。达到铁浓度所需的C-PAM-10粉末的量，将0.1M在pH值3.0,5.5和8.0的10mL的0.04M磷酸盐水溶液（摩尔比Fe:PO43-= 1:0.4）中温育。将悬浮液置于振荡水浴中，在37℃下低振荡运动2小时。溶化后，通过3kD超滤器过滤悬浮液。结合的磷酸盐与氧化铁颗粒形成沉淀，因此被过滤器保留并保留为过滤残余物。未结合的磷酸盐通过过滤器并最终进入滤液。使用滤液来确定吸附的磷酸盐的量和释放的铁的量。被吸附的磷酸盐的量被描述为加入和未结合的磷酸盐之间的差异。磷酸盐被检测为磷锑钼蓝络合物，并且释放的铁离子被确定为三（1,10-菲咯啉）铁（II）络合物。
2.7．在pH 1.2-7.5范围内模拟胃肠道（GI）传代
在过量磷酸盐中进行体外模拟GI通道以确定磷酸盐结合剂的最大磷酸盐结合能力。因此，将达到0.028M的铁浓度所需的C-PAM-10粉末的量在40mL的0.04M磷酸二氢钠一水溶液（Fe:PO43-= 1:1.4的摩尔比）中培养。将pH调节至1.2后，将样品置于滴定器中，在37℃低温搅拌下孵育1小时。随后将pH增加至2.5，持续1小时，随后pH 4.5持续1.5小时，pH 7.0持续2小时，并且最终pH达到7.5持续2.5小时。在每个时间点后，在pH升高到下一个更高的pH水平之前取样。样品通过3kD超滤器过滤。使用滤液来确定吸附的磷酸盐的量和释放的铁的量。
碳酸司维拉姆的磷酸结合能力的测定在相同的实验条件下进行。司维拉姆碳酸盐是一种不同大小的复杂交联聚合物，其中每个颗粒被认为是大分子。因此，司维拉姆碳酸盐不具有一种特定的分子量，而是具有作为粒度分布函数的分子量分布（Sanofi-aventis Canada Inc.，2013）。为了简化样品制备，需要约350mg的相同重量的C-PAM-10以形成摩尔比Fe：PO43-如上所述的1:1.4也用于司维拉姆碳酸盐。在此司维拉姆碳酸盐浓度下，磷酸盐仍然过量，因此磷酸盐的结合能力没有因缺乏磷酸盐而减少。
2.8．在pH 4.5-7.5范围内模拟胃肠道传代
含有浓度为0.028M Fe的聚山梨醇酯80的C-PAM-10在40mL 0.04M磷酸盐水溶液（摩尔比Fe:PO43-= 1:1.4）中温育。在低温搅拌下在37℃下在滴定仪中进行温育，并在pH 4.5下开始3.5小时。随后将pH升高至pH 7.0达2小时，最后达到pH 7.5达2.5小时。在每个时间点后取样以确定磷酸盐结合能力。
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