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氮化硅-羟基磷灰石复合材料的体外生物活性
摘要:氮化硅基陶瓷具有高的耐化学性、优异的断裂韧性、硬度和生物惰性。然而，生物应用通常需要额外的特性，例如生物活性使其能够更牢固地与宿主组织结合。溶胶-凝胶法制备羟基磷灰石涂层，提供了纯净、稳定、纳米晶的产品，是生物惰性陶瓷生物活性的实现途径之一。因此，将羟基磷灰石前驱体溶胶渗透到氮化硅基多孔陶瓷中制备了氮化硅-羟基磷灰石复合材料。将溶胶制备条件优化为适合于纯HA合成：在高温（85℃）老化和在500℃下煅烧1小时。测试了Si3N4-HA复合材料的细胞毒性和体外生物活性，以验证羟基磷灰石对复合材料生物学性能的影响。将多孔复合材料浸入模拟体液中21天后，氮化硅-羟基磷灰石复合材料表面形成磷酸钙层，显示出其生物活性。
关键词：氮化硅；磷灰石；生物医学应用；生物活性
一 引言
骨科手术的进展必然与新型生物材料的开发有关，这些材料在结构、力学和生物学特性方面都适合作为骨替代物。一般要求包括腐蚀性体液中的高化学惰性、高耐磨性、足够的机械性能和生物相容性。满足上述所有条件的高级陶瓷材料是金属或聚合物的一种很有前途的替代品。与常规使用的氧化物生物陶瓷相比，氮化硅作为非氧化物陶瓷提供了几个优点，主要是显著提高了断裂韧性和耐磨性，导致植入物的高可靠性。这些属性结合其化学耐久性，使这种材料成为高负荷医疗应用的合适候选材料。因此，大多数研究都集中在致密氮化硅上，目的是取代用于髋关节和膝关节假体的金属合金。除了致密的氮化硅基陶瓷外，多孔陶瓷也被广泛研究用于生物应用。具有类似松质骨结构的多孔氮化硅已经商业化地用作脊柱融合植入物，其骨内生长速率与多孔钛的报道相似。对植入动物的多孔结构中骨生长的研究结果表明，多孔氮化硅适用于需要直接生物骨固定的植入物。
羟基磷灰石（HA）是骨骼和牙齿的主要成分。它占人体骨材料的70%。由于HA与人体骨组织的化学相似性，合成HA对宿主硬组织具有很强的亲和力。与宿主组织的化学结合在临床应用中比大多数其他骨替代物，如同种异体骨或金属植入物提供了更大的优势。然而，纯羟基磷灰石的力学性能不足以满足高负荷应用，因此羟基磷灰石经常用于复合材料或涂层中。
已经报道了几种羟基磷灰石的合成方法，如固相反应、水热法或溶胶-凝胶法，溶胶-凝胶法的优点是产物均化程度高、纯度高、结构精细。相比于其他方法制备的羟基磷灰石，溶胶-凝胶法制备的羟基磷灰石具有更高的生物相容性，这与其产物结晶度差，晶格中存在碳酸盐离子有关。另一方面，Ca和P前体完全反应形成HA并避免CaO的保留需要很长的反应时间，这会降低HA的生物相容性。因此，有几项研究涉及此主题。
本文主要研究了具有生物活性氮化硅基复合材料的制备。根据1987年欧洲生物材料学会（ESB）会议共识，生物活性材料是“一种被设计用来诱导特定生物活性的材料”。Kokubo和Takamada认为生物活性材料是骨结合材料。材料与活体骨结合的基本要求是植入生物体内时在其表面形成骨状磷灰石。这种在体内形成的磷灰石可以在模拟体液（SBF）中复制，其离子浓度几乎等于人血浆的离子浓度。因此，Kokubo和Takadama对生物活性的定义意味着，生物活性材料是一种当浸入类血清溶液中时，类骨羟基磷灰石将选择性形成的材料。
在我们之前的工作中制备的多孔Si3N4基陶瓷材料满足了生物应用的所有微观结构要求，并且表现出非常接近人类小梁骨的力学性能（抗压强度4.11.9MPa，杨氏模量11.20.9GPa）。陶瓷体的双峰孔隙率为组织生长和营养输送提供了必要的大孔（dgt;100mu;m），为细胞粘附和生物代谢产物吸附提供了较小的孔（dlt;50 nm），如人小梁骨。根据总孔隙率和孔径分布，多孔Si3N4的抗压强度可以在370MPa到10MPa的范围内变化，占总孔隙率的20%-80%。81%孔隙率的纯羟基磷灰石支架的抗压强度为4.5MPa，与小梁骨相似。小梁骨的杨氏模量约为11GPa。通过适当改变总孔隙率和孔径分布，Si3N4基质也可以获得小梁骨的抗压强度和杨氏模量。多孔陶瓷的强度-孔隙率和杨氏模量-孔隙率特性可由以下方程描述：
式中，sigma;和Eo为零孔隙率强度和杨氏模量，sigma;和E为孔隙体积分数P处的强度和弹性模量，A、B和C为与孔隙特征相关的常数。致密Si3N4材料的抗压强度（京瓷SN-240材料为3200兆帕，CeramTec SL200B氮化硅材料为3000兆帕）远高于致密羟基磷灰石的报告抗压强度800兆帕或917兆帕。致密Si3N4的杨氏模量为290GPa，致密羟基磷灰石的杨氏模量为110GPa。考虑到这些数据来自致密材料，Si3N4基材料的总孔隙率比HA材料高，大孔隙率（dgt;100mu;m）高，强度和杨氏模量相近。因此，将具有生物相容性的Si3N4负载基质与具有生物活性的HA结合在支架材料的制备上具有广阔的应用前景。为此，本研究选用Si3N4基材料作为支架材料的基体，并将其表面涂覆生物活性HA。
本工作的目的是制备具有生物活性的Si3N4-HA复合材料，其结构保证了细胞的粘附和随后的营养供给，同时满足了力学性能的所有要求。将测试两种Si3N4材料：空气烧结氮化硅（ASSN）和反应烧结氮化硅（SRBSN）。这些Si3N4基材料的多孔结构和力学性能已经得到优化，类似于人小梁骨。因此，这两种材料都将用于本文骨支架的制备。
2 材料和方法
采用聚氨酯海绵复型法制备氮化硅基样品。采用了两种不同的方法——在第一种方法中，用体积分数为35%的Si3N4粉末（烟台，汤姆利高科技公司和特拉中国有限公司，d50=0.4mu;m，d90=1.0mu;m，Olt;1.4%）制备氮化硅悬浮液。使用去离子水作为液体介质，为获得最佳分散效果，每克粉末中添加0.022 g分散剂（达万氯化萘，美国范德比尔特）。用氮化硅球对悬浮液进行了24小时均匀化处理。将聚氨酯海绵浸入泥浆中，并在浸泡时进行压缩，以填充海绵中的所有细胞，实现海绵与泥浆之间的良好润湿。然后，浸渍海绵通过滚筒去除多余的悬浮液。海绵干燥后，在600℃下在空气中燃烧1小时（加热速率：1℃每分钟）。随后的烧结在1250℃的空气中进行；加热速率为10℃每分钟，冷却速率为20℃每分钟。这些样品被描述为空气烧结氮化硅（ASSN）。
在第二种方法中，通过反应烧结制备多孔氮化硅基体，并将材料描述为SRBSN（烧结反应结合氮化硅）。SRBSN样品是由悬浮在去离子水中的重量比为3：1的粉末混合物制成的，该粉末混合物包含48wt％由硅（4D级，d50=7mu;m，西科米尔，维斯塔陶瓷公司，瑞典）和alpha;- Si3N4（SN-E10，日本宇部工业株式会社，日本）组成的粉末混合物。为了获得最佳分散效果，每克粉末添加0.07 g分散剂。用Si3N4球磨球对悬浮液进行了24小时均化处理。将聚氨酯海绵浸渍于浆料中，通过辊压机处理去除多余的悬浮液。海绵干燥后在空气中600℃烧制1h，1400℃氮化3h，1750℃烧结2h。更多陶瓷性能详见于我们之前的工作。
以亚磷酸三乙酯（C2H5O）3P（Sigma Aldrich公司，德国）和硝酸钙Ca（NO3）2（Lachema公司，捷克共和国）为磷和钙源，采用溶胶-凝胶法制备了多孔氮化硅基体的羟基磷灰石涂层。我们对合成工艺进行了优化，特别是在陈化温度和煅烧温度方面，得到了单相HA。在石蜡密封的玻璃容器中，用去离子水和亚磷酸三乙酯在强搅拌下水解24小时，制备了亚磷酸钠溶胶，亚磷酸钠与水的摩尔比为8。水解24小时后，将化学计量的硝酸钙溶液逐滴添加到水解的亚磷酸酯溶胶中，乙醇被用作溶剂。然后将混合溶胶溶液在室温下搅拌1-3天。该部分溶胶在80℃下老化8小时。干燥的凝胶在500-850℃下煅烧，以估计获得纯HA相的最佳煅烧制度。用X射线衍射（PANalytical Empyrean，荷兰）分析了样品的相组成。
用羟基磷灰石前驱体溶胶浸润Si3N4基多孔材料制备复合材料。干燥后，重复渗透，样品在500℃下在空气中煅烧1h。用压汞法测定了制备的复合材料的总孔隙率和孔径分布（PoreMaster 60，Quantachrome，美国）。通过煅烧后样品重量的增加来计算HA的渗透量。
Kokubo等人提出的将样品浸泡在SBF中于pH7.32，温度维持在37.00.1℃进行体外生物活性评估。SBF溶液的成分和浓度与人血浆相似。SBF的离子浓度（mM）为：Na :142.0；K :5.0；Ca2 :2.5；Mg2 :1.5；Cl-:148.8；HCO3-:4.2；HPO24-:1.0；SO24-:0。浸泡时间分别为7天和21天。浸泡后，将试样从液体中取出，用去离子水冲洗，并用扫描电镜和能谱仪（JEOL JSM-7600F/EDS/WDS/EBSD）对试样表面进行了研究。浸泡21天后，通过ICP OES（VISTA MPX，Varian，荷兰）确定溶液中溶解物质的浓度。
使用人成纤维细胞（细胞系BHNF-3）应用MTT试验（甲基噻唑基四唑）来检验所制备材料的细胞毒性。MTT法检测未经处理对照组的细胞存活率。将人成纤维细胞置于6孔板上，加入1.5*105个细胞，立即加入多孔陶瓷样品。用酶联免疫吸附试验（BioTek EL 800，美国）通过检测48h后490nm波长的吸光度，观察细胞增殖情况，用扫描电镜（EVO 40，蔡司，德国）观察细胞形态。
3 结果和讨论
3.1 氮化硅陶瓷
以聚氨酯海绵为造孔剂，采用模板法成功制备了空气烧结氮化硅（ASSN）和反应烧结氮化硅（SRBSN）两种多孔Si3N4基材料。我们之前的工作描述了这些细节。孔隙结构和抗压强度与小梁骨相似。天然骨和两种氮化硅基陶瓷——ASSN和SRBSN的孔结构如图1所示。
图1（a）天然骨，（b）空气烧结氮化硅和（c）反应结合氮化硅的宏观结构。
采用与人体骨骼样本相同的方法对材料进行了表征。两种类型的陶瓷材料ASSN和SRBSN均满足生物应用的微观结构要求，并表现出与小梁骨相似的力学性能（表1）。MTT增殖试验证实了多孔氮化硅基陶瓷材料的非细胞毒性。
表1骨和氮化硅基陶瓷样品的机械性能。
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人骨 |
空气烧结氮化硅 |
反应烧结氮化硅 |
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硬度/GPa |
0.51plusmn;0.03 |
0.46plusmn;0.07 |
6.6plusmn;2.3 |
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杨氏模量/GPa |
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