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生态毒理学与环境安全47,186-194（2000）环境研究，B部分
十六种化学品对四种藻类和无脊椎动物的慢性毒性试验
Pascal Radix,Marc Leonard,ChristosPapantoniou,Gilles Roman,ErwanSaouter,Sophie Gallotti-Schmitt,HerveThiebaudand PauleVasseur
使用四个慢性毒性测试的表现进行比较，包括甲壳类动物大型水蚤、轮虫、月芽藻和慢性氨苯磺胺22的小时测试。研究了16种具有6个数量级毒性的化学物质。研究发现在月牙藻的72h NOEC 和EC10之间有非常高的相关性。轮虫和微藻类的毒理学反应与80％的病例（16种化学物中有13种符合）水蚤的反应程度相同。慢性氨苯磺胺预测了水蚤试验的总体结果，但与月牙藻和轮虫相比，预测相当不精确。月牙藻的72小时后生长抑制作用的测量试验是十分最敏感的。通过测量56％和43％的病例中的光合色素或二乙酸荧光素的直接荧光，可以在5小时后估计72小时后微藻的毒性。藻类，轮虫和细菌的EC10和EC50比值的中值分别为3.75、2和1.5。
前言
慢性毒性数据的使用对化学品的生态毒理评估至关重要。 大多数需要生命周期持续时间的慢性毒性试验费用昂贵且需要大量劳动力。一个现实的评估需要使用属于不同营养级别的几种测试物种，这需要额外的成本。由于生物的敏感性和生态相关性，短期生命周期生物测定法很受关注，特别是在测试不稳定样品时。藻类，细菌和水生无脊椎动物是有吸引力的生物体，例如鱼类因为它们的生殖跨度比高等生物短。此外，微生物测试需要较小的体积用于测试，这对于生态毒性筛选和环境生物监测是有用的。
在这篇文章中，对四种慢性毒性试验的性能，成本和简单性进行了比较。欧洲当局可能要求进行大型水蚤的21天测试用于评估新物质的水生慢性毒性。这个测试是敏感、标准化、有据可查的。需要使用月牙藻作为测试生物的藻类测试来评估对光合物种的毒性并且也被标准化。除了培养72小时后的常规细胞计数之外，5小时后进行荧光测量来检测任何早期毒性。慢性毒性试验使用细菌生物发光作为22小时潜伏期后的终点。化学物质的抑制作用影响细菌产生发光的能力，这是细胞分裂，代谢，生长和萤光素酶诱导的组合功能。轮虫测试是基于抑制轮虫的繁殖。使用的生态毒理学测试这些淡水无脊椎动物相关的生态意义和优势已经叙述。(Snellet al.,1991;Snell and Moffat,1992;Janssenet al.,1993). 轮虫的生育期短，对污染物高度敏感。 它们产生可以非常容易储存和孵化的囊肿，没有必要对受试生物进行培养(Persoone,1991;Janssen et al.,1994)。 该测试目前正在进行标准化程序（AFNOR），四项测试的评估涉及16种化学品。
实验材料与方法
氨苯磺胺慢性毒性试验
氨苯磺胺慢性毒性测试是测量在278℃下22小时的潜伏期后生物数量的减少。由细胞代谢耗尽诱导的毒性效应通过发光强度的降低来表示。他的测试系统使用了细菌试剂，培养基和氨苯磺胺温控光度计(Vibriofischeri supplied in freeze-dried form)。试验介质中含有盐类，含有适当的营养物质;主要是NaCl 35 g / L，它的pH值是7.5。试剂和设备由Azur Environment提供(Carlsbad, CA)。每个样品用5个浓度进行测试，每个样品一式四份。使用五水硫酸铜作为阳性对照，测试按照供应商手册中描述的程序进行(Azur Environmental, 1996)。
藻类实验
测试按照ISO 8692标准进行(ISO, 1989)。所使用的藻类菌株P. subcapitata是单细胞叶绿素，藻类生长培养基是ISO培养基，含有各种营养素和微量元素。 藻类在无菌条件下培养，只有对数期的培养物用于接种。测定在125 ml艾伦美式烧瓶中进行，用恒定光线3000勒克斯照射并以速度150 rd/min搅拌，温度维持在238 。每个试样含有45 ml品和5 ml以确保最终的藻浓度为每毫升5.105个细胞，该测定一式三份进行。
培养5小时后，用直接荧光测量法和二乙酸荧光素法(Gilbert et al., 1992)评估毒性。 温育72小时后，用直接荧光细胞计数测量毒性。从2毫升等分试样用438 nm激发滤光片和684 nm发射滤光片测量直接荧光。与对照相比，低荧光水平表明光合色素水平降低，因此对光系统有毒性。
荧光素二乙酸酯（Sigma，St Louis.MO）在丙酮溶液中制备至1g / L的浓度，并在 -20℃下避光保存。FDA是一种亲脂性非荧光分子，很容易被细胞摄取。 活细胞内的非特异性酯酶切割酯键，产生荧光素，在紫外光下呈绿色荧光(excitation 472 nm,emission 510 nm)。荧光强度取决于细胞的酯酶活性和细胞膜的完整性，这两者都揭示了藻细胞的生理健康(Berglund and Eversman, 1988)。FDA方法将2ml孵育样品与20ml FDA溶液在室温下在黑暗中温育1小时。与对照相比，低荧光水平表明毒性与细胞代谢的全面损害，用分光光度计测量荧光。温育72小时后用Coulter计数器（CoultronicZM）进行细胞计数，结果以浓度表示。
轮虫的2天实验
该测试测量对轮虫繁殖的毒性。 它是根据Snell和Moffat在1966年进行的改编和执行的。试验开始前约20小时，在合成淡水中启动囊肿孵化。在1 L去离子水中合成淡水由96mg NaHCO3，60mg CaSO4·2H2O，60 mg MgSO4·7H2O KCl组成，调节pH至 7.5 (Snell and Moffat, 1992)。在25℃，3000勒克斯光强度下进行孵化，温育18小时后，检查囊肿以确保在孵化2-3小时内收集测试动物。
该测定在48孔微量培养板中进行，其允许测试5个浓度和一个对照，重复8次。在每个孔中引入800微升用于对照的合成淡水的测试化学品稀释液，然后用200毫升绿藻Chlorella vulgaris的悬浮液完成。稀释藻类以确保每孔中每毫升最终浓度为3x106个细胞。试验是通过将一只新孵化的轮虫转移到孔中开始的，转移是在显微镜下用微量移液器完成的。接下来，用微孔板覆盖微孔板并密封以减少蒸发。 然后在25 ℃黑暗中温育。 培养48小时后，计算每口活雌体的总数。 结果用浓度来表示。
水蚤的21天测试
该测试基于21天暴露后生殖抑制的测量，这个实验使用了已公开的实验数据。从文献获得的月牙藻的 NOEC值选自根据标准方法进行的研究或在作者描述的受控条件下进行。所报告的NOEC值在接触21天后进行测量，除非另有说明。10种化学物质的NOEC值在文献中找不到，因此在实验中进行了测量。如经济合作开发组织试验准则202第二部分所述，进行21天大麦蛾繁殖试验。水浓度为140-160mg / L，以CaCO3表示，pH为8.5plusmn;0.2，温度为20plusmn;18℃; 新生儿年龄小于24小时，静态更新设计为21天，在三甲基氯化铵（TMAC），甲基丙烯酸丁酯（MABU），丙烯酸（AAC），甲基丙烯酸乙酯（MAE）和甲基丙烯酸（AMA）的测试中使用流通条件。在每种情况下，在测试溶液中测量测试化学品的浓度。 除了丙烯酸的NOEC，三甲基氯化铵（TMAC）和十二烷酸（FA）之外，结果用浓度表示，其表示为测量浓度。一些特定的条件测试温度为258℃的十二烷酸，用十二烷基硫酸钠（AS）进行的测试，水硬度为210-220mg / L，以CaCO3表示。
表1列出了四种测试在材料、持续时间、简单性和成本方面的对比。所给出的分数是相对的，反映了作者的经验。
化学品测试
无机和有机化合物如合成中间体，金属、染料、表面活性剂和杀虫剂被选定来做测试（表2）。4-氯苯酚（纯度499％）和磷酸三丁酯（99％纯度）来自Aldrich。 二氟硝基邻甲酚（纯度498％）来自Fluka。甲基丙烯酸丁酯（499.5％），丙烯酸（99.8％），甲基丙烯酸乙酯（99.1％）和甲基丙烯酸（97.1％）来自Elf-Atochem。由Procter and Gamble生产三甲基铵，十二烷基硫酸钠和十二烷基硫酸钠（纯度大于99％）。 其他测试物质是从Merck购买的。
表1 用水蚤的21天试验鉴定受试化合物的亲油性（用Log POW表示）和NOEC值（来自文献或实验）
数据分析
通过假设检验来确定NOECs，例如Dunnett和Williams的检验。 NOEC是测试的最高浓度，与对照组差异不显着（风险a = 5％）。NOEC取决于测试浓度的选择，并且通过定义是测试浓度之一。 使用TOXSTAT软件进行计算。使用对数 - 逻辑模型通过非线性回归测定EC10和EC50
a，b是曲线形参数（由算法调整），ECx是计算出的端点（由算法调整），x是对ECx 的百分比影响，c是测试化学物质的标称浓度，y是测量值（新生儿数，生物发光单位，荧光单位，细胞数）。EC10和EC50的95％置信区间由回归算法提供。 使用STATGRAPHICS Plus软件进行非线性回归分析（Statgraphics，1995）。
使用STATGRAPHICS Plus软件进行聚类分析。 这些簇是具有相似特征的变量组。 为了形成簇，程序从一个单独的组中的每个变量开始。然后它将两个呈现最接近灵敏度的变量组合起来，形成一个新的组。 在重新计算组之间的距离之后，将两组最接近的组合在一起。 这个程序是重复的，直到只剩下一个组。
结果
16种化学物质的毒性表示为NOEC，EC10和EC50，并且在表3中按照对水蚤毒性降低的顺序呈现。这16种化学物质涵盖了广泛的毒性，包括6个数量级。 对水蚤的毒性最大的物质为铜，三甲基氯化铵，ENV203和五氯苯酚，对藻类和轮虫或细菌的EC50低于1mg / L。第二组的特点是毒性较低（其中一个EC50值低于10mg / L）包括4-氯苯酚和二硝基邻甲酚（DNOC），表面活性剂十二烷基苯磺酸钠（LAS）和十二烷基硫酸钠（AS ）和丙烯酸。 其他化学品毒性较低，EC50值高于10 mg / L，有时为100 mg / L; 这些是甲基丙烯酸及其衍生物，ENV 204和ENV 207以及十二烷酸。
在接触铜，磷酸三丁酯（TBP），DNOC，MABU，ENV207和AMA 5小时后，通过抑制荧光测量（直接荧光和FDA）可以预测藻类72小时后的毒性。这反映了光合作用活性和细胞活力的改变，并伴随细胞生长再生。 在暴露于ENV 203和AAC 5小时后记录光合色素荧光的抑制而不损害细胞活力。相反，LAS、AS和ENV 204的暴露通过FDA测量快速诱导细胞毒性，而直接荧光则没有受到影响。 藻类暴露于TMAC、五氯苯酚和4-氯苯酚后72小时内的高毒性记录不能通过这些早期控制来预测。
表2 通过Brachionus 2天（BC）和Microtox慢性试验（MIC）获得的NOEC，EC50，EC10
比较测试的四个反应，以评估每个测试预测其他反应的能力。 使用对数转换数据，通过每个测试获得的EC10或NOEC值之间的差异。平均差异很小表明反应有很高的相似性（准确的预测），这种差异的低标准偏差表明结果的分散性很低。然后，将平均差异和标准偏差反向转换为精度因子和精度因子，该精度因子和精度因子将用于表示两类测试之间的相似程度（表3）。
讨论
环境风险评估可能需要了解关注区域的不同营养级别的慢性毒性。 目前对细菌，光合物种，轮虫和无脊椎动物进行的研究满足了这一要求。它包括两项欧洲化学品立法标准化和测试要求的测试，即水蚤的21天测试和藻类生长抑制测试。月牙藻和慢性氨苯磺胺测试可用作慢性毒性的方法。 这些易于执行并且反应迅速的微生物检定物被发现是用于评估化学物质水蚤的21天检验的相关替代物(Radix et al., 1999)。
尽管EC50值比NOEC和EC10有更高的准确度，但长期没有毒性影响和确保环境质量的“安全浓度”水平的评估与诱导，使得相关活的物种有50％干扰的浓度。实际上，水蚤的21天试验中常用的终点是NOEC，这是标准方法要求的，用于评估环境风险评估的预测无效浓度（PNEC）。使用NOEC进行慢性生态毒性评估，最近受到了反驳（OECD，1998），主要是出于统计的原因，因为价值取决于测试浓度的选择和重复次数。有一个共识是，应该使用基于回归的估计程序来确定更合适的EC10或EC20。 因此，在本研究中除了NOEC之外还计算EC10。结果分析显示NOEC和EC10对轮虫，细菌和藻类而言是相似的。 图1表明，NOEC在Brachionus二维测试中在全球非常接近EC10，在慢性氨苯磺胺和藻类测试中稍低。这些结果意味着在大多数情况下，NOEC可以被EC10替代，而不会引起风险评估的重大变化。 由于EC10可以用置信区间表示，因此比NOEC更令人满意。
表3 四个实验的相似程度及另一个测试预测的准确性
图1 四种生物的NOEC/EC10,EC<sub
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