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亚硝化过程中的氨氧化菌超声强化研究
郑敏，刘艳臣（通讯作者），辛佳，左昊，汪诚文，吴唯民
摘要
废水亚硝化的关键在于将氨氮氧化为亚硝酸盐而不是硝酸盐。本文提出一种可行的超声辐射技术来强化氨氧化菌的活性，同时抑制亚硝酸盐氧化菌的活性。批式活性实验表明随着超声强度逐渐增加，氨氧化菌活性呈现峰状，而亚硝酸盐氧化菌活性则持续下降。对批式实验中相关微生物活性及超声强度进行动力学分析，以研究操作条件（能量、污泥浓度、曝气）对氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌活性的影响，并由此确定反应器实验参数。接着用序批式反应器以合成尿液为进水进行小试实验，每天超声辐射时间为8小时。当超声能量密度为0.09KJ/mg VSS，连续进水NH3-N浓度超过200mg/L时，氨氧化菌生殖活性强，且氨氮几乎完全转化为亚硝酸盐。微生物结构分析说明超声处理改变了氨氧化菌、亚硝酸盐氧化菌和异养生物的群落结构。对比反应器进行超声辐射时和停止超声辐射30天后，已知的氨氧化菌Nitrosomonas的种群数量维持在相似水平，而典型的亚硝化氧化菌Nitrospira完全消失。
1 背景介绍
近年来，相比于常规硝化-反硝化的方法进行污水脱氮，短程硝化或厌氧氨氧化技术具有能耗小、碳源需求小、占地少的优点，因而受到广泛关注。这种反应要求通过控制微生物代谢途径，使氨氮氧化为亚硝酸盐而非硝酸盐，其反应方程式如下：
（1）
实现亚硝化主要基于对微生物种群的选择，要求抑制或淘汰亚硝酸盐氧化菌从而使氨氧化菌占优势。目前，研究人员已经提出多种方法可以实现选择氨氧化菌并抑制亚硝酸盐氧化菌。1998年，短程硝化工艺（SHARON）第一次被提出，此工艺采用中温（30℃-40℃）和较短的污泥龄（约1.5天）以强化亚硝化过程。目前，实现亚硝化的常用方法是维持低溶解氧、控制pH和控制游离氨及游离亚硝酸浓度。但是，在完全抑制亚硝酸盐氧化菌活性的条件下，部分氨氧化菌活性也可能被抑制。已投入生产的部分亚硝化/厌氧氨氧化工艺经验表明亚硝化过程的稳定运行至关重要。如果亚硝化过程由于进水水质/水量变化、反应条件失控或现场事故等突然冲击而失稳，那么将会耗费较长时间以恢复反应效率。例如，Joss et al.曾提出短暂的减少溶解氧耗造成的亚硝化-厌氧氨氧化工艺故障时间长达一个月。其原因在于当氨氧化菌部分流失或活性降低后，会使生物驯化过程中氨氧化菌生长缓慢。因为污水处理厂的新鲜活性污泥含有氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌两种硝化细菌，接种此活性污泥可以成功恢复或启动亚硝化过程。但是从污泥中选择氨氧化菌和抑制亚硝酸盐氧化菌仍是关键问题。
超声波是一种振荡声波，其频率大于20000Hz，超过人耳可听声范围。超声波处理主要应用于实验用清洁剂和均质机、水和废水的消毒和通过损坏细胞强化厌氧消化中的生物降解能力。此外，有实验结果表明超声辐射可以提高微生物生产率、促进生物降解、恢复废泥中活性生物量、强化除磷和厌氧氨氧化菌活性。曾有研究人员发现超声辐射对废水脱氮有一定作用，Zhang et al.发现在超声波辐射下减少污泥浓度可以显著提高有机物、氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐负荷。研究结果表明硝化菌（氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌）对超声波十分敏感，并且超声波处理可以明显强化反硝化过程。近期研究表明三种不同强度的超声波辐射对有机物去除、亚硝化和反硝化的综合性能产生影响。此发现表明超声波处理有希望成为选择氨氧化菌（强化氨氧化菌活性并抑制亚硝酸盐氧化菌活性）的一种方式，可以用此方式启动亚硝化反应器和维持反应器中氨氧化菌的优势地位。我们认为超声波处理对生物反应的影响是双面的，因此需要进行更多实验。
本实验的目的在于表征超声辐射对氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌活性的双面影响，以及验证超声波强化氨氧化菌活性、抑制亚硝酸盐氧化菌活性以快速启动亚硝化反应器的可行性。本实验内容包括：(a)超声波对主要功能菌群（氨氧化菌、亚硝酸盐氧化菌、异养微生物）活性的影响；(b)小型序批式反应器测试超声波对亚硝化过程的强化效果，及长期稳定运行亚硝化反应器；(c)针对反应器中氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌的微生物群落分析。我们进行了有关微生物活性和比超声能量密度的动力学分析，以探究运行参数（能量密度、污泥浓度和曝气）对氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌活性的影响。分析表明批式实验数据与动力学方程吻合。结果证实了超声波对氨氧化菌活性有显著影响，合理地控制超声强度可以强化氨氧化菌活性并抑制亚硝酸盐氧化菌活性以快速启动亚硝化反应器。
2 材料及方法
2.1批式实验
在3.0L容量瓶中进行平行实验。取清华大学生活污水处理厂（清华污水回用，北京）硝化污泥为接种物，加入到容量瓶，搅拌，经超声波发生器（SCIENTZ-ILD, Ningbo Xinzhi Co-,Ltd.，运行参数范围：9.5-950W，0-999分钟，20-25kHz）连续辐射，定期取样进行微生物活性分析。分别测定每组实验中氨氧化菌、亚硝酸盐氧化菌、异养微生物在不同超声强度、功率、有效容积、污泥浓度和有无压缩空气进行曝气条件下的活性，总结如表1 所示：
表1 各工况下氨氧化菌、亚硝酸盐氧化菌动力学常数
|
测试条件 |
氨氧化菌 |
亚硝酸盐氧化菌 |
|||||||
|
序号 |
功率（W） |
体积（L） |
挥发性固体浓度（mg/L） |
f |
b |
R2 |
f |
b |
R2 |
|
1 |
100 |
1.5 |
4890 |
5314 |
-4.7 |
0.969 |
4212 |
-4.6 |
0.954 |
|
2 |
300 |
1.5 |
5370 |
3180 |
-2.9 |
0.992 |
2432 |
-2.5 |
0.985 |
|
3 |
600 |
1.5 |
5470 |
2073 |
-2.3 |
0.865 |
0 |
-5.7 |
0.972 |
|
4 |
600 |
1.5 |
3900 |
8823 |
-19.8 |
0.975 |
0 |
-7.0 |
0.945 |
|
5 |
100 |
2.0 |
2270 |
2682 |
-2.3 |
0.993 |
468 |
-1.9 |
0.995 |
|
6b |
100 |
2.0 |
2270 |
6087 |
-30.7 |
0.991 |
518 |
-21.1 |
0.957 |
（注：常数f和b由方程9计算得到，6号实验为曝气条件。）
2.2反应器的启动和运行
实验在两组小型序批式反应器中进行，一组配备超声波发生器（ZJS-1000-500，100W，40kHz，杭州成功超声波设备有限公司)，另一组不进行超声处理（对照组）。反应器呈圆柱状，材质为有机玻璃，高为30cm、内径为12cm、有效容积为2.7L。实验周期为8h，水力停留时间为1d。每个周期包括四个阶段：进水5min、搅拌和曝气7h、沉淀55min、出水5min。进气速度为0.6L/min，以维持曝气阶段溶解氧浓度超过1.0mg/L。
本实验中超声处理的运行条件与本研究小组之前的实验相似。超声波发生器在每个周期进水完毕后开始工作，设置频率为40kHz，辐射时间为0.5-2h（取决于实验条件），两次超声辐射的时间间隔等于运行周期，为8h。对照组不辐射超声波。本实验以分离的人体尿液为进水，该水样氨氮浓度为684.5plusmn;54.3mg/L，化学需氧量为587.5plusmn;102.4mg/L，pH为8.8plusmn;0.1。该废水水质与文献中报道的分离尿液相似。反应器接种大型市政污水处理厂的常规硝化污泥。反应器运行期间进行氨氧化菌的增殖能力和微生物群落分析。
2.3分析方法（化学分析和计算）
COD、NH4 -N、NO2--N、NO3--N、VSS根据标准方法测定，DO、pH和温度由pH/DO计（WTW, pH/Oxi340i）自动记录，FA和FNA依据Anthonisen等记录的方法进行计算。
超声波处理强度用能量密度（Es,kJ/ml）和比能量密度（E spec,kJ/mg VSS）表示，计算公式如下：
（2）
（3）
式中：P——超声波功率，W；
t——作用时间，s；
V——反应器/容量瓶有效体积，L；
VSS——挥发性悬浮固体浓度（微生物浓度），g/L。
反应器出水亚硝酸盐积累率（NAR）如下计算：
（4）
式中：NO2-——出水硝酸盐浓度；
NO3-——出水硝酸盐浓度。
2.4生物活性测定
三种营养菌群氨氧化菌、亚硝酸盐氧化菌、异养生物的活性在批式培养反应器中进行，用最大氧耗量(OUR max,mgO2/(L·h))表示，反应器有效容积为300ml。在呼吸监测过程中，通过给药选择抑制剂烯丙基硫脲和NaClO3来分别监测氨氧化率和亚硝酸盐氧化率（Surmacz-Gorska et al.）。并分别使用浓度为10mgN/L的氨氮和亚硝酸盐底物测定氨氧化菌、亚硝酸盐氧化菌活性，异养微生物活性在内源呼吸条件下测定。
2.5氨氧化菌生殖活性测定
氨氧化菌生殖活性用最大生殖速率（u max-b）表示，在进行好氧亚硝化批式实验后用IAWQ模型计算得到。从反应器中取5ml污泥试样，于批式反应器中进行超过3天的曝气（DO＞4mg/L)培养，反应器基质如下：100mg/L NH4 -N、770mg/L NaHCO3、155mg/L K2HPO4、1385mg/LKH2PO4和微量元素（Zheng et al.）。反应温度控制在25plusmn;2℃，pH用2.5N氢氧化钠溶液调整至7.25plusmn;0.10。定期取样进行硝酸盐和亚硝酸盐分析。将硝酸盐和亚硝酸盐浓度的自然对数与时间作曲线，生殖活性（u max-b）为该曲线斜率。
2.6 DNA提取物
取污泥试样于5000rpm下离心4min，根据制造说明书用土壤DNA快速提取试剂盒(MP Biomedicals ,LLC,Solon,OH)提取DNA，然后用乙醇沉淀提纯。选用Nanodrop2000型超微量分光光度计测定DNA浓度，以保证DNA在260nm和280nm下的吸光度比值、260nm和230nm下的吸光度比值分别大于1.8和2.0。取3.0micro;LDNA溶液于1%凝胶中，检测DNA质量。
2.7Illumina Miseq基因测序和数据分析
以提取的DNA为模板，采用引物338F和860R对细菌16s RNA的V4-V5区域基因片段进行扩增。扩增子在Illumina Mis
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