在真实环境浓度下通过转录组学分析探究加巴喷丁对斑马鱼胚胎产生毒性的机制外文翻译资料

 2022-08-04 14:08:55

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Environmental Pollution 251 (2019) 746e755

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Environmental Pollution

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在真实环境浓度下通过转录组学分析探究加巴喷丁对斑马鱼胚胎产生毒性的机制★

Yide He a, Xiuwen Li a, Dantong Jia a, Wenming Zhang b, Tao Zhang a, Yang Yu a, Yanhua Xu a, Yongjun Zhang a, *

a 中国江苏省南京工业大学（211816）环境科学与工程学院

b 中国江苏省南京工业大学（211816）生物技术与制药工程学院

文章信息

文章历史：

接收：2019年2月28日

修订接收：2019年5月8日

接受：2019年5月13日

线上发表：2019年5月14日

关键词：

加巴喷丁

生态毒性

转录组学

神经系统

免疫系统

摘要

随着全球医疗行业对于加巴喷丁(Gabapentin,GPT)的广泛应用，其逐渐成为了一种新的水环境污染物。在本文的研究中，我们使斑马鱼的胚胎暴露于真实环境浓度的加巴喷丁下（0.1 mg/L和10 mg/L），从而对这种新出现的污染物的生态毒性进行评估。本文采用了深度测序的转录组学分析的方法对其具体机制进行揭示。斑马鱼（Danio rerio）12 hpf至96 hpf胚胎暴露于GPT下时分别有136个和750个基因发生了差异表达。基因本体（Gene ontology,GO）分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto rncyclopedia of genes and genomes,KEGG）途径分析结果表明大量差异表达基因（Differentially expressed gene,DEG）均属于抗氧化剂系统、免疫系统和神经系统。本文采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）对RNA-测序结果进行验证，直接证据证明上述系统中的所有选定基因的表达都有降低。乙酰胆碱酯酶（AChE）、溶菌酶（LZM）和C反应蛋白（CRP）的含量均在接触结束时降低，这一现象与转录组学结果相一致。本文的结果表明，即便在与环境有关的浓度下，GPT能够对斑马鱼早期发育阶段的多种重要功能产生影响。

copy; 2019 Elsevier Ltd. 版权所有。

  1. 简介

自首次进行临床应用之后，加巴喷丁（GPT）就一直作为抗惊厥药进行使用(Chadwick, 1995)。随后该药物也被用于对癫痫、神经性疼痛和尿毒症瘙痒等疾病的治疗(Gilronamp;JL, 2006; Lauet al., 2016)，其广泛的应用造成抗生素被大量消耗。但GPT的生物降解是非常困难的，因此大量的GPT通常都通过尿液排出体外(Kasprzyk-Hordern et al., 2008)。以德国为例，仅2016年就有大约80吨的GPT被排入德国市政污水系统(Henning et al., 2018a)。与此同时，污水处理厂（STP）对于污水中GPT的清除效率是非常低的。在德国污水处理厂Dresden Kaditz的流入和流出水中，GPT的最高浓度分别为13.2plusmn;3.3 mg/L和12plusmn;2.6 mg/L(Gurke et al., 2015)。

多篇研究证明污水处理厂（STP）清除效率低与GPT极低的生物可降解性有关。例如，Herrmann et al.通过闭瓶实验发现测试进行28天后的理论需氧量达到了7.9%plusmn;3.6%，因此可以将GPT归类为难生物降解化合物(Herrmann et al., 2015)。

由于污水处理厂清除效率较低，因此GPT频繁在水体系统中被检测出(Margot et al., 2016)。在美国明尼苏达州，24个城市的排放废水中都检测出GPT，其浓度在数十纳克每升至若干毫克每升(Writeret al., 2013)。南威尔士的地表水GPT浓度在11-1879 ng/L(Kasprzyk-Hordern et al., 2008)。不仅如此，德国地表水、地下水和自来水中的GPT浓度分别为3.2 mg/L, 1.3 mg/L和0.64 mg/L(Henning et al., 2018b)。水体环境中无处不在的GPT使得生态毒性研究更加迫切，因为目前已经有临床研究表明GPT能够对大鼠产生神经性毒性(Karagoz et al., 2013)。但目前仅有有限的生态毒性数据可供参考。我们此前的研究已经发现GPT的暴露导致斑马鱼生命的早期阶段受生态毒性影响，但具体的影响机制目前仍不明确(Li et al., 2018)。在本文研究中，我们采用深度测序转录组学分析的方法首次将GPT对斑马鱼胚胎的毒性作用机制进行揭示。转录组学技术能够利用有限的测试样本为我们提供大量的信息，从而将传统生态毒性检验推向了革命性的全新发展阶段(Pina amp; Barata, 2011)。分析差异表达的基因以及其富集途径能够为对于生态毒性机制的理解提供全面的依据。此外，我们还使用如下所述的三中生物标记物对转录组学结果进行验证。乙酰胆碱酯酶（AChE）能够使脊椎动物和无脊椎动物神经功能中十分重要的胆碱能突触中的神经递质乙酰胆碱发生水解(Guilhermino et al., 2000)。溶菌酶（LZM）拥有多种生物功能，如抗病毒、免疫调节、抗炎和抗肿瘤等(Wang et al., 2015)，并且可以作为一种灵敏可靠的生物标记物对污染物对于生物体免疫系统产生的毒性作用进行评估(Zhou et al., 2017)。C反应蛋白（CRP）一直以来都被认为是参与了先天和适应性免疫活动的主要急性期蛋白(Sinha et al., 2001)。

  1. 材料与方法
    1. 化学物质

GPT（纯度＞98%）由中国上海市阿拉丁试剂（上海）有限公司供应。CaCl2·2H2O（纯度＞99.0%）由中国上海市国药集团化学试剂有限公司供应。MgSO4·7H2O（纯度＞99.0%）、NaHCO3（纯度＞99.5%）和KCl（纯度＞99.5%）由中国上海市上海凌峰化学试剂有限公司供应。TRIzol由中国上海市Invitrogen公司供应。Dnase I由中国北京市New England Biolabs公司供应。PrimeScript II RTase、随机引物、dNTP混合物、SYBRreg; Premix Ex Taqtrade; II (Perfect Real Time)等由中国北京市TaKaRa公司供应。AChE试剂盒购自中国南京市南京建成生物工程研究所。LZM试剂盒与CRP试剂盒购自中国合肥市Lai Er Bio-tech公司。

    1. 动物与GPT暴露

6 hpf（妊娠后小时数）野生斑马鱼（德国品种）胚胎由中国南京市南京树梨花生物科技有限公司供应，在我们的研究实验室中使用胚胎培养基液进行培养，相关化学品与其浓度参考(ISO 6341-1982)(Qiang et al., 2016)，在GPT下暴露至12 hpf。在96 hpf时，胚胎使用0.1 mg/L和10 mg/L的GPT进行处理，已囊括各种真实环境浓度(Gurke et al., 2015; Writer et al., 2013; Kasprzyk-Hordern et al., 2008; Henning et al., 2018b)。每组同时进行三份实验。在此半静止暴露实验中，3/4的液体培养基每天更换一次。使用带盖培养皿作为胚胎容器。为将液体培养基的浓度保持在稳定的水平，所有胚胎均在孵化器中进行保存，其温度为28plusmn;0.5℃，光照/黑暗周期为14/10小时。测得pH值为7.17plusmn;0.03，导电率为294.3plusmn;3.2 ms/cm。在暴露实验期间，死亡胚胎均以最快速度移除，避免其暴露介质中滋生细菌。

    1. RNA分离与测序

暴露结束时，胚胎和新孵化的鱼苗均放入冰上进行灭杀。然后在4℃条件下在40000 rpm转速下进行15分钟均质化并离心操作。RNA采用TRIzol (Invitrogen, UK)进行提取，然后在室温下添加DNase I (New England Biolabs)并放置15分钟以去除DNA，随后使用苯酚-氯仿-异丙醇试剂进行进一步纯化。对样本进行定型检测后，仅核糖体RNA带清晰可见、28s:18s的亮度比约为2:1、OD26/OD280的比例在1.8和2.2之间、浓度超过500 ng/mL且RIN（RNA完整性数）值超过8.0的样本予以选用进行后续步骤的实验。RNA总量测定和表达库的建立均采用TruSeq RNA Sam

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