加巴喷丁对斑马鱼早期发育及其抗氧化系统的生态毒理学效应研究外文翻译资料

 2022-08-04 14:19:50

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加巴喷丁对斑马鱼早期发育及其抗氧化系统的生态毒理学效应研究

加巴喷丁(GAB)是一种新兴的污染物，在全球各地的水体中经常被检测到。 本研究以斑马鱼为模型生物，研究GAB对斑马鱼的早期发育及其抗氧化系统的影响。急性毒性实验表明，96h的LC50的斑马鱼胚胎GAB值为59.9gL-1。进一步观察到GAB引起胚胎畸形，如血凝和心包水肿。与对照组相比，当GAB(plt;0.05)浓度超过50mgL-1时，心率显著增强，当GAB(plt;0.05)浓度为100mgL-1时，游泳频率明显增加。 此外，斑马鱼胚胎的发育也受到GAB负面影响，表现为身体长度明显减少。GAB的浓度超过50mgL-1时导致器官畸形和异常运动显著影响斑马鱼的发育。虽然在GAB浓度(0.1和10mu;gL-1)下没有观察到明显的发育影响效应，但对其抗氧化系统的进一步研究发现，生物体内部因氧化剂发生了严重的损伤。以过氧化氢酶(CAT)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、谷胱甘肽(GSH)和抑制羟基自由基(IHR)的抑制能力作为生物标志产生对不同浓度GAB的毒性。结果表明：在GAB环境暴露后CAT、LDH、GST和IHR的活性均升高，且ROS是由GAB暴露引起的。在所有这些生物标志物中CAT是评价GAB影响的最有效的生物标志，即使在非常低的浓度(0.1mu;gL-1)下暴露也有显著的增加。

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收到2018年5月18日接受2018年6 月2日

DOI：10.1039/c8ra04250k

rsc.li/rsc-advances

导言

药物和个人护理产品(PPCPs)的广泛使用，令其在全球水生环境中分布广泛并且频繁被检测到。 例如，在1999-2000年期间研究人员抽样的美国河流，其中80%的样品检测到一种或多种化学品。加巴喷丁(GAB)是一种抗癫痫药物，用于治疗部分癫痫和神经病理性疼痛。1 2009年，德国消耗了58.9吨GAB，2012年增至73.3吨。2,3 GAB在许多亚洲国家也得到了广泛的应用，如中国、印度、新加坡等。4–6 GAB不易在生物群中被分解，因此人体排泄率很高。7,8 当污水处理厂排放(STPs)时，其去除效率极低。

a 南 京 理 工 大 学 环 境 科 学 与 工 程 学 院 ， 江 苏 ，211816， P. R.. 中国 。电 子 邮 件 ：heyd@njtech.edu.cn； y.zhang@njtech.edu.cn； 电话： 86-25-58139656

b湖南省可再生能源电气技术重点实验室，湖南长沙，410076，中国

3 例如，R. Gurke等人在德国的STPs和出水中检测到56种PPCPs，并且发现GAB的去除效率仅为6.4%。9 在明尼苏达州，研究人员对24种STP废水和很多种类的PPCP进行了采样，检测到其中GAB的浓度各不相同均在ngL-1范围内。10 STPs去除效率很低导，致其在世界各地的地表水需要多次检测。在英国和美国，检测的GAB浓度水平均在ngL-1。11,12 在瑞士维迪湾，在饮用水里中检测到GAB浓度为400ngL-1。13 水生系统中的频繁检测到GAB，这引起了人们对其生态毒性的担忧，据我们有限的了解，在学术中很难找到相关于GAB生态毒性的研究内容。

在本研究中，斑马鱼(DanioRerio)被用作模型生物。 与传统的动物模型相比，斑马鱼有许多优点，如体积小，长成时间短，产卵量大，胚胎发育快速等。14–16 另外，胚胎及幼体时期的斑马鱼都是透明的，17,18 所以其相对容易观察到不良反应，如有毒物引起的异常变化。

近20年来，斑马鱼在毒性实验中得到了广泛的应用。16–20胚胎毒性(FET)标准化OECD测试，用其做急性测试是最常用的替代手段。21 在其整个生命周期，胚胎和幼体阶段是对化学物质反应最明显的阶段。22–25 在孵化前，胚胎被绒毛膜包围约72小时中可能会在发育胚胎和化学品间提供一个保护屏障。26,27 本研究将暴露时间延长到192hpf(培育时段)包含更重要发育阶段，从而获得更多关于生态毒性的信息。

暴露于污染物中的鱼类表现出明显的抗氧化防御能力，这些抗氧化防御能力被用作水生环境健康的生物指标。28 抗氧化酶，包括过氧化氢酶(CAT)和乳酸脱氢酶(LDH)是一条防御外氧化应激的主要标志，29 谷胱甘肽系统，包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)和谷胱甘肽(GSH)是次要标志。30 另外，几个非酶机制也可以表现抗氧化防御，如抑制羟基自由基(IHR)的能力。31 肝脏是这些抗氧化酶产生的地方，目的是为了消除生物体中的活性氧(ROS)。32 然而，在本研究中使用的96hpf的幼体太小，无法分离肝脏组织，因此使用整个幼体作为样本为酶活动测试做准备。

材料和方法

    1. 化学品

GAB(CAS60142-96-3，纯度gt;98%)是从阿拉丁工业公司购买的。NaCl(CAS7647-14-5，纯度gt;99.5%)购自西隆科有限公司。CaCl2-2H2O(CAS10035-04-8，纯度gt;99.0%)购自中化试剂有限公司4MgSO4-7H2O(CAS10034-99-8，纯度gt;99.0%)，NaHCO3(CAS144-55-8，纯度gt;99.5%)和KCl(CAS7447-40-7，纯度gt;99.5%)分别购自上海凌峰化学试剂有限公司。CAT套件( CAT.no：KGT017) ，GSH试剂盒( CAT. no：KGT006)，GST试剂盒(CAT. no：KGT005)，LDH试剂盒(CAT.no：KGT02448)，OH试剂盒(CAT.no：KGT010)和Bradford蛋白定量测定试剂盒(CAT.no：KGT801)是从KeyGEN生物技术有限公司购买的。

    1. 斑马鱼培育和产卵收集

成年野生型斑马鱼(Tubingen线)是从南京YSY生物技术公司购买的，在我们的实验室培育至少一个月，然后在实验中使用。培育方法遵循其他地方详细描述的标准指导。33 成年斑马鱼被保护在一个在28plusmn;0.5℃的孵化器中且具有14/10小时的光和暗循环。 他们每天在5分钟内喂三次活的幼虾。在产卵前一天，一只雄性和一只雌性被转移到繁殖箱中，然后通过分割板被分离。

第二天，当光周期开始时，取出分割板，在一个小时内用胚胎培养基水收集胚胎并洗涤几次， 检测出其中含有2 mM CaCl2-2H2O， 0.5 mM MgSO4-7H2O， 0.75 mM NaHCO3 和0.08 mM KCl(ISO 6341-1982)。34

    1. 急性毒性实验

实验中GAB的NOEC值为10gL-1。12 然而，没有计算LC50斑马鱼胚的GAB浓度的急性毒性实验。 对于一般急性毒性实验，将胚胎从12phf开始持续96小时暴露在含有50、56、60、63、67、71gL-1的GAB试液中。 这种暴露浓度是由一系列的预实验决定的。 在浓度为 4mg-1有水的阴性对照和有水的阳性对照。3,4-二氯苯胺曾经在研究已使用。 选择12孔细胞培养皿（康宁公司，美国制造）作为实验室。 将10个活卵放入一个4mL培养液的槽中。 每个实验准备三个样本。用盖子覆盖培养皿防止暴露期间蒸发，还有保持孵化器温度在28plusmn;0.5℃，pH在7.11plusmn;0.05，电导率在293.6plusmn;2.4mu;scm-1以及14/10小时的光和暗循环。在这种半静态暴露实验中，每天更换3mL培养液。 每24小时取出死胚并记录。

    1. 生长期毒性实验

本实验是根据OECD TG236、OECD TG210和OECD TG212 组织准则设计和修改的。35–37 将GAB浓度梯度设定为0.1mu;gL-1，10mu;gL-1，0.1mgL-1，1mgL-1，10mgL-1，50mgL-1 还有100mgL-1并加上没有GAB的阳性对照和阴性对照。每组进行三次重复实验。培养条件与急性毒性条件相同。

在以下时间点观察胚胎或幼虫：6hpf，8hpf，12hpf，24hpf， 48hpf，72hpf，96hpf，120hpf，144hpf，168hpf，192hpf用生物倒置显微镜(日本尼康120c)或立体显微镜(江南JSZ6S，中国)拍照。 每天计算孵化率。 每个被测胚胎的根尖表现包括：胚胎凝固，没有躯体形成，尾巴不脱落，没有心跳。 畸形包括：色素沉着；卵黄畸形，心包水肿；卵黄囊水肿；血凝；尾部变形； 囊缺损。38,39

为了观察GAB对斑马鱼发育的影响，使用几个端点来识别测试组和对照组之间的变化，如表1所示。40,41

    1. 抗氧化系统实验中的生物标志物

从12hpf到96hpf，实验组的胚胎暴露于0.1mu;gL-1，10mu;gL-1 和1mgL-1 的GAB中，代表最坏的情况下现实的环境浓度与药学相关的浓度。

表1本研究中使用的时间节点

时间(hpf)

终点

方法

48

心跳率

在显微镜下观察30s的心跳

72

尸体长度

拍摄和测量幼体的照片

144

游泳频率

记录30s内自发游泳行为的次数

192

干重

显微镜

干燥24小时，温度为60℃后的恒重

每组使用三个培养条件与上述急性毒性实验相同。暴露结束时，96hpf幼虫和胚胎在低温下死亡，4℃时使用手持式细胞破碎机

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