1,4-二恶烷的生物降解作用：酶诱导物和三氯乙烯的影响外文翻译资料

 2023-01-10 14:46:04

1,4-二恶烷的生物降解作用：酶诱导物和三氯乙烯的影响

Steven Hand, Baixin Wang, Kung-Hui Chu⁎

Zachry Department of Civil Engineering, Texas Aamp;M University, College Station, TX 77843-3136, USA

摘要：1,4-二恶烷是地下水污染物和可使人类致癌物。在这项研究中，研究在不同的氧的表达条件下，两个经过仔细的降解菌分枝杆菌JOB5和红球菌jostiiRHA1检查它们在其共污染物三氯乙烯（TCE）的存不存在降解1,4-二恶烷的能力，。

这两个菌株用R2A液体培养基（复合营养培养基）来进行预培养，补充丙烷或1-丁醇以诱导不同的表达氧酶。使得丙烷和1-丁醇诱导JOB5和RHA1能够降解1,4-二恶烷，三氯乙烯，和1,4-二恶烷/三氯乙烯的混合物。

观察到只有在1,4-二恶烷/三氯乙烯混合物完全降解丙烷致应变JOB5。观察到1,4-二恶烷和三氯乙烯的所有单元之间抑制。此外，由1-丁醇诱导JOB5引起的产物毒性1,4-二恶烷不完全降解。

在一般情况下，TCE 更多降解，产品细胞毒性更大; 然而，易患产物毒性被认为是既应变和诱导依赖性的。这项研究的发现为1,4-二恶烷原位修复方法提供了根本基础发展，包括下水和1,4-二氧杂环己烷降解野生型菌株RHA1研究。

关键词：1,4-二恶烷； TCE；共代谢降解；生物修复；产品毒性

1.简介

1,4-二恶烷，一种常见的溶剂稳定剂，已在美国和日本的地下水和地表水被检测出。和有限的1,4-二氧杂环己烷接触可引起呼吸道刺激症状，而慢性接触则可引起皮肤、肝、肾损害。在国际癌症研究机构（IARC）归类中1,4-二恶烷为可能的人类致癌物。 虽然环保局还没有发出1,4-二恶烷咨询水平，但1,4-二恶烷是污染物候选名单。目前科罗拉多州已设定出0.35微克/升清理的水平(美国环保局，2013)。目前仅有高性价比的原位修复1,4-二恶烷污染场所用于处理其物理和化学性质。

1,4-二恶烷是一种非挥发性的无色液体具有低的有机碳。分配系数(log Koc= 1.23)和低辛醇-水分配系数(log Kow=minus;0.27)，因为地下水是流动性很强，所以1,4-二恶烷一旦释放到地下。仅仅靠化学氧化像氯化和高级氧化技术补救大量稀释的1,4-二恶烷是不切实际的。

同样，虽然自然衰减1,4-二恶烷是可能的，但是它稀释后是无处不在的。1,4-二恶烷是可生物降解的，一些纯和混合培养物和已知通过降解1,4-二恶烷的生长连接的或者非生长联降解机理（共代谢反应）。是在原位生物强化可以是一个有吸引力的治疗选择。

在已知的降解领域中，分枝杆菌 JOB5（称为JOB5下文）和红球菌jostii RHA1（称为RHA1下文）是特殊的降解菌。

因为：(i)丙烷生长JOB5可以降解1,4- 二恶烷，丙烷生长 RHA1可以降解亚硝胺; (ii)这两种 JOB5和RHA1可以表达氧酶共同代谢降解 TCE和其他氯化溶剂，这也存在于1,4-二恶烷，影响地下水; (iii)这两种菌株在代谢上多种多样的，使它们能够在多个基板上生长容易。

共代谢降解通过抑制常见产品毒性，关于1,4-二恶烷降解氯化合的污染物影响，特别是为底物抑制和产品的毒性有关，仍然了解不佳。

两种菌株可以用液体营养培养基加速生长，而用气态底物如像丙烷和丁烷，细胞生长在营养丰富的介质不能降解1,4-二恶烷或对于经过NAT化合物由于缺乏诱导剂（丙烷和1-丁醇） 降解酶的表达。对于这些菌株，已知丙烷和1-丁醇不仅作为主基板，而且作为诱导剂，丙烷单加氧酶或丁烷单加氧酶表达分别。因此，我们假设：(i)野生键入RHA1能降解1,4-二恶烷; (ii)细菌表达不同氧酶导致不同的降解潜力1,4-二恶烷; (iii)产物的毒性，从​​1,4-二恶烷的降解所产生及其共同的污染物影响的1,4-二恶烷降解潜力氧表达JOB5和RHA1。

因此，本研究进行（a）将探索野生型1,4-二恶烷的降解潜力表达不同氧酶时的应变RHA1;（b）检查可溶性诱导（1-丁醇）和气态诱导的影响（亲上的1,4-二恶烷中的存在的降解潜力窗格）产品的毒性和酶完成这两个菌株;（c）在确定的降解共污染物的效果当用不同的表达二氧杂环己烷由株JOB5和RHA1类型氧酶。三氯乙烯被用作模型氯化共污染物在这项研究中。三氯乙烯对1,4-二恶烷降解的影响化，特别是与底物抑制和产品的毒性，进行了测定。

2.材料和方法

2.1化学制品

1,4-二恶烷（99％）购自阿法埃莎公司；三氯乙烯（99％）购自Sigma-Aldrich公司；丙烷（N99.9％）购自MP公司；1-丁醇（ge;99.4％）购自Fisher Scientific；四氮化-dianisidine购自Fluka化学品公司；萘购自阿法埃莎公司；碘化丙单氮化物（PMA）是购自Biotium公司。

2.2菌株和培养条件

菌株JOB5由Robert Steffan博士提供。菌株RHA1由加拿大不列颠哥伦比亚大学Bill Mohn博士提供。 菌株RHA1和JOB5培养在50ml在30℃的2A（R2A）肉汤培养基培养箱以150rpm而摇动约48小时，直到OD600=0.8~1.0。再通过细胞离心10,000times;克收集 5分钟，5分钟后，然后洗涤，再悬浮于铵矿物盐（AMS）的介质。以OD600=0.8~1.0一升AMS含有10.0g的(NH4)2HPO4、8.66g,Na2HPO4、1.71g,K2SO4、0.37 g,MgSO4·7H2O、0.12 g,CaSO4·2H2O、0.22 g ,FeSO4·7H2O, 0.02 g、KI, 0.06 g、ZnSO4·7H2O,、0.03 g,MnSO4、0.01g ,H3BO3,和0.11 g, CoSO4.悬浮培养物用1-丁醇（10毫克/升）或丙烷 （40％的顶部空间体积/体积）处理24小时分别以诱导丁烷的表达或丙烷单加氧酶。然后将细胞通过离心10,000times;g 下 5分钟进行收获，再用和悬于AMS介质OD 600 = 0.5~1.0的实验使用。

2.3测定非特异性氧酶的活性

为了确认非特异性单加氧酶的表达，非特异性单加氧酶在模型菌株活性为用比色萘氧化法检测。

2.4降解测试

把5mL1,4-二恶烷的液体放入在一系列的40毫升的1,4-二恶烷的生物降解玻璃瓶中，用特氟隆涂覆的密封样品隔垫和螺帽。其中包含任意丙烷或应变JOB5（或RHA1）和20毫克/升的1,4-二恶烷的细胞。最初的细胞浓度使用分光光度计在A600和作为挥发性悬浮固体（VSS）确定为光密度。两个附加套降解实验中，一组有三氯乙烯（5毫克/升）只，而另一组用的1,4-二恶烷（20毫克/升）的混合物中和的TCE（5毫克/升）。所有样品包括相应的杀菌了控制。然后将瓶子在保温在30℃72小时150转环境下。72小时后，将样品从培养箱取出并采取气相样品确定1,4-二恶烷和三氯乙烯浓度。

2.5化学分析

将200mu;L的TCE顶部气体样品注射到安捷伦6890N气相色谱（GC）/火焰离子化检测器（FID）系统中。使用（2015）154-159122-5532G毛细管柱（248mu;m直径times;30.0米）。从标准TCE溶液中生成的三氯乙烯的校正曲线，范围从0.05〜5毫克三氯乙烯/ L的水相。按照朱和阿尔瓦雷斯-科恩(Chu andAlvarez-Cohen, 1996)编制的TCE的标准溶液查询标准曲线然后生成量化TCE的浓度。检测限为三氯乙烯液体0.05毫克/升。数据收集和分析均使用安捷伦化学工作站软件，通过比较三氯乙烯中的控制浓度与三氯乙烯的活性细胞样品中的浓度，以确定相对降解百分比。

在1毫升每1毫升二氯甲烷液体样品的比用二氯甲烷作描述byDraper等人的1,4-二恶烷的液体样品中萃取。Draper et al. (2000)。然后将样品涡旋以150rpm混合并孵育16-24小时在30℃的培养箱。所提取的样品的第二十fivemu;L注入安捷伦科技6890N气相色谱/火焰电离检测系统，以确定1,4-二恶烷浓度。标准曲线然后生成量化1,4-二恶烷浓度为1毫克/升，检出限。数据收集和使用安捷伦化学工作站软件分析。的1,4-二恶烷中丧生控制浓度与1,4-二恶烷活性细胞样品中的浓度进行比较，以确定相对百分比降解。

2.6活/死细胞分化

活细胞通过使用丙啶单氮化物（PMA）进行预处理，对样品进行定量实时PCR分析。PMA作为可以进入膜受损的细胞（认为是死细胞）来修改（推测）死细胞的DNA，以防止从PCR反应。活细胞仅可以将DNA PCR扩增。此法已成功地用于定量活的细菌细胞分析，从活细胞和死细胞分化前和降解目标化合物用碘化丙单氮化物（PMA）染料分析。

3.结果与讨论

3.1 1,4-二恶烷和三氯乙烯的降解

无论是1-丁醇还是丙烷引起JOB5和RHA1都具有不同的降解能力，可以降解三氯乙烯和1,4-二氧杂环己烷。实验表明丙烷诱导JOB5和RHA1可比降解能力朝向1,4-二恶烷(Fig. 1A) 如示于图。图1a和B的，丙烷诱导JOB5降解更加优于三氯乙烯和1,4-二恶烷（分别1.7plusmn;0.6和4.4plusmn;1.2毫克每细胞干重毫克污染物（CDW），和1-丁醇诱导JOB5（分别0.18plusmn;0.09和每CDW毫克2.4plusmn;0.8毫克污染物）。观察为丙烷和1-丁醇诱导RHA1类似的趋势（图1a和B的）这些结果表明，丙烷与1-丁醇比为更好诱导剂，间接表明丙烷单加氧酶是更有效的用于污染物降解比丁烷单加氧酶。

在所有的细胞中，丙烷诱导JOB5显示了较高的TCE降解能力，为（每1.7plusmn;0.6毫克三氯乙烯降解每毫克CDW）。该值数量级比1-丁醇诱导的JOB5要更高，并且高于由1-丁醇和丙烷引起RHA1。这相当于丙烷生长JOB5的降解TCE有较高的研究价值，例如JOB5通过24小时后 2.6毫克/升的TCE去除效果(Wackett et al., 1989)。以前的研究已经报道了一系列不同氧化表达培养物（表1），包括丙烷生长JOB5的1,4-二恶烷转化能力。研究丙烷诱导的JOB5转化1,4-二恶烷能力，丙烷生长在（2.8plusmn;0.0141,4或更高的CDW假设50％（重量/重量）CDW作为蛋白质）JOB5毫克。

三氯乙烯和单独1,4-二氧杂环己烷由丙烷和细胞，TCE或1,4-二恶烷的量退化的表示为的（毫克每毫克生物污染物）。使用丁醇诱导细胞1,4-二恶烷降解实验重复至少4次。TCE降解使用丙烷和1-丁醇诱导细胞实验重复至少两次。在杀死控制测量的非生物损失被认为高于显示的数据。

（A）丙烷诱导细胞降解三氯乙烯和1,4-二恶烷中三天。

（B）1-丁醇诱导细胞降解三氯乙烯和1,4-二恶烷中的三天。

丙烷生长的菌株，必须培养大约一周，达到高光密度。细胞生长可能通过丙烷在水中的低溶解度的限制。在这项研究中表明，在24小时内JOB5和RHA1可以迅速地培养至光密度（OD 600）1.0。培养的细胞，可以进一步诱导丙烷或1-丁醇，用于1,4-二恶烷降解所需的单加氧酶。我们的研究结果牵连快速增长大量必要在生物强化污染场地的降解细胞的潜力。

3.2 1,4-二恶烷在三氯乙烯退化的影响

无论诱导物，JOB5和RHA1两种菌株能够降解1,4-二恶烷和1,4-二恶烷/三氯乙烯混合物。但三氯乙烯的存在对于降解潜力影响很大（表2，图2）。JOB5降解5.2~7.7和1.8~5.7毫克每毫克CDW，1,4-二恶烷时分别（图2）用丙烷和1-丁醇孵育。TCE和1,4-二恶烷的混合物在，丙烷和1-丁醇诱导JOB5劣化少得多1,4-二恶烷，2.9-7.0和0.8-4.7毫克每毫克CDW，分别1,4-二恶烷（图2）。同样，RHA1劣化少1,4-二恶烷n中的三氯乙烯/1,4-二恶烷混合物。只有1.3-4.6和0.4-1.5毫克每毫克1,4-二恶烷CDW由丙烷和1-丁醇诱导RHA1，分别为（表2）降解。在降解所有的差异被认为是通过配对更为显著。

3.3 1,4-二恶烷和其混合物降解的产物毒性

产物毒性由于1,4-二恶烷和其混合物的降解是由前相比存活细胞和降解后评估。降解后仅1,4-二恶烷，丙烷和1-丁醇诱导细胞表现出16％和42％的减少。此外，降解1,4-二恶烷/三氯

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