添加有机碳底物和重金属（Pb和Cr）对土壤微生物群落的影响外文翻译资料

 2022-04-28 22:48:02

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添加有机碳底物和重金属（Pb和Cr）对土壤微生物群落的影响

Cindy H. Nakatsu,1 * Nadia Carmosini,1,2 Brett Baldwin,1 Federico Beasley,1 Peter Kourtev,2 and Allan Konopka2

农学系1和生物科学系2普渡大学，西拉斐特，印第安纳州47907

摘要：用重金属（Pb和Cr）和芳香烃污染的土壤进行微观实验，以确定各自对微生物群落结构和功能的影响。有机基质被添加作为改变微生物群落的驱动力。葡萄糖代表了各种细菌使用的能源，而预计只有较少土壤种类使用二甲苯。选择金属改良剂以抑制50％或90％的有机矿化的急性速率，并且在整个31天的潜伏期中持续存在较低的矿化速率。除有机碳之外还添加了金属时，重大的生物量增加停止了。单独添加有机碳对群落组成具有最显着的影响，并且导致一些优势系统型的增殖，如通过细菌16S rRNA基因的PCR变性梯度凝胶电泳检测到的结果。然而，两种碳源之间的重金属添加的群落范围效应不同。对于葡萄糖而言，Pb或Cr会产生大的变化并用新的系统型进行替换。相反，当加入任何金属时，通过二甲苯处理选择的许多系统型都被保留。放线菌成员在二甲苯和Cr（VI）的微环境中非常普遍；通过实时PCR确定的联苯双加氧酶和苯酚羟化酶（但不是其他加氧酶）的基因拷贝数在这些微环境中升高。需要较低的金属浓度来抑制二甲苯的分解代谢，而不是葡萄糖。 Cr（VI）在31天的培养过程中似乎减少了，但在葡萄糖的情况下，当大部分Cr（VI）保留时，有大量的微生物活性。在二甲苯的情况下，这不太清楚。

重金属在空气，水和土壤中的使用和释放已经在美国和全世界造成了大量受污染的地点。因此，过去几十年来，金属污染对微生物群落的影响已经被广泛研究。短期暴露于有毒重金属对各种微生物过程的急性影响已有详细记录[9,10,21,40,47]。最近，调查人员研究了长期暴露于人为或天然金属污染的生境[5,20,22,24,39,45]。专注于微生物群落可培养部分的研究表明，长期污染的生境中少至10％至几乎100％的细菌是金属抗性的。因此，群落对地点之间金属暴露的反应可能存在很大差异。随着基于非种植的方法的出现，研究人员开始研究金属暴露对整个土着群落的影响[6,24,25,26]，并试图解决这些暴露对群落多样性的影响[30]和弹性[15]。

受金属污染的地区混杂因素是有机污染物的频繁共存。这些有机分子可能是可代谢的能源，毒物或两者。金属和有机碳污染物对微生物活动和群落组成的综合影响尚不清楚，因为没有研究解决这一问题。如果物种丰富度在被复杂混合物污染的场地中减少，则群落可能不太具有适应性，因为生态型能够实现特定所需功能的可能性降低了[13]。我们实验室以前的研究表明，长期混合污染场地中的微生物群落结构可能反映出土壤中的金属和芳香烃浓度。对于单个微生物在复杂条件下持续存在，它们必须能够耐受本地金属和碳氢化合物污染物。 Shi等人[42]在这些土壤中的微生物群落中发现了非常广泛的金属耐受性分布。这与微生物在高度污染和未污染的微生物中的异质分布一致。

对于这项研究，我们使用微观世界来分离两种金属Pb和Cr的影响，并研究芳香烃对微生物群落结构和活性的影响。通过使用微观世界，土壤可以均匀分布微生物种群和毒物，从而减少空间变异性。这使我们能够测试实验添加的Pb2 或Cr6 并评估它们对微生物群落的影响。增加了两种能量基质之一（葡萄糖或二甲苯），为选择操作和驱动群落组成变化提供了必要的力量。葡萄糖被微生物广泛使用；二甲苯分解代谢在微生物中受到更多限制，并且二甲苯模仿存在于这些土壤中的芳香族化合物。群落活动的变化与群落组成和功能基因水平的分子分析有关。

材料和方法

土壤微观世界。用于微观实验的土壤于2001年6月27日从位于印第安纳州西摩的印第安纳州交通部门收集，该地区受金属和石油烃污染[21a]。为这些微观实验选择的土壤来源于该地点污染程度较低的地区；Pb和Cr总量分别为20和6mg·kg-1土壤。将土壤贮存在4 ℃下直到开始微观实验前7天，当它被转移到1L容器用于驯化时，其包括日常土壤混合和通气。

土壤微环境由含有12g干重土壤的100ml血清瓶组成。总共测试了八种金属-碳源组合和三种对照处理。这些组合包括具有低或高Pb的葡萄糖或二甲苯，具有低或高Cr的葡萄糖或二甲苯，以及仅添加葡萄糖、仅有二甲苯并且不添加有机或金属的对照处理。以每克土壤3000g的浓度添加二甲苯或葡萄糖。初步实验确定在该浓度下碳矿化达到最大。将无菌葡萄糖溶液加入到微观世界中，而将二甲苯加入到土壤中，首先将418mu;l二甲苯混合到10g沙子中，然后将1g二甲苯-沙子混合物加入到每个微观世界中。为了减少挥发，所有二甲苯添加都是在干冰上进行的。土壤被手动混合以尽可能均匀分布底物。选择金属浓度以将底物诱导的碳矿化减少50％（L）和90％（H）。在初步实验中确定每种底物的这些浓度。L和H金属浓度分别为3和10mg·g-1 Pb（相当于36和12mmol·kg-1）与葡萄糖或二甲苯，0.4和4mg·g-1 Cr（VI）（相当于16和160mmol·kg-1）与葡萄糖和10g和18g Cr（VI）（相当于0.4和0.7mmol·kg-1）与二甲苯。作为Pb(NO3)2的Pb和作为K2CrO4的Cr（VI）的溶液均匀地分散在微观世界中。将每个缩影的最终含水量调整到60％的持水量；如前所述（11），在测量土壤的持水能力后进行调整。然后密封这些缩影。他们每周都要称重以检查水分含量是否保持在同一水平。

对于CO2，总生物量（磷脂磷酸盐）和土壤DNA测量，在第0,4,7,10,13,16,20,25和31天对三个微观世界进行破坏性取样。首先，使用注射器从每个微观世界移除0.5ml顶空气体并注入气相色谱仪（HP系列II 5890）中以测量CO 2含量。 使用1g土壤立即从二甲苯加高Cr微观世界中估计可培养的耐Cr和二甲苯降解细菌的数量。 对于接受Cr（VI）的微观世界，用水提取1g土壤，并用二苯卡巴肼试验分光光度法测定可溶性Cr（VI）的量[12]。 对于微生物群落分析，将2g土壤置于微量离心管中并冷冻直至DNA可被提取。 将剩余的土壤储存在小型自封袋中并冷冻以用于生物量（磷脂-PO4）和脂肪酸甲酯分析。

磷脂分析。使用Findlay[16]的方法提取磷脂。一式三份用10克土壤进行提取。使用甲醇-氯仿-磷酸盐缓冲液（1：2：0.8）从土壤中提取总脂质，并且通过柱层析分离磷脂。微生物量由土壤中磷脂-PO4含量估算。使用比色测定法[1]，使用100mu;l的磷脂提取物来测定过硫酸钾消化后的磷脂-PO4的量。

列举可培养的细菌。在第0天（在加入二甲苯和Cr之前）从二甲苯加-高-Cr微观世界的1g（湿质量）土壤中计数可培养的细菌和耐Cr的细菌，分别为4，7，10，13，16，20，25和31。首先将土壤悬浮于10ml异生生物基础盐培养基[23]中并涡旋。制备污物悬浮液的连续稀释液（102-105），并将100 mu;l样品一式三份涂布在带有二甲苯加1mM K2CrO4的异生生物基础盐琼脂平板上，并且在0.1和0.1％营养琼脂（NA）平板上加入和不加入5 mM K2CrO4。提供二甲苯作为饱和用于培养板的外壳的气氛的蒸气。在25℃孵育4或7天后计数菌落数。

DNA提取，PCR和变性梯度凝胶电泳（DGGE）。根据制造商的说明，使用用于土壤的FastDNA旋转试剂盒（QBIOgene，Carlsbad，CA）提取来自约0.5g土壤的土壤DNA。使用含有溴化乙锭（0.3g·ml-1）的0.7％琼脂糖凝胶中的提取物的分辨率来估计DNA数量和质量。

如先前所述，通过来自16S rRNA基因的PCR产物的DGGE随时间改变微环境的微生物群落的变化[31,33]。简而言之，通过使用引物PRBA338f（5AC TCC TAC GGG AGG CAG CAG 3）[32]和GC夹钳（5-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG（SEQ ID NO：3））扩增16S rRNA基因的V3区域G-3）和引物PRUN518r（5-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3）[27]。 PCR混合物包含1个PCR缓冲液（Promega，Madison，WI），3.5mM MgCl2，0.8mol各脱氧核苷三磷酸，0.1％牛血清白蛋白，0.5M（各）正向和反向引物，5U Taq聚合酶和150mu;g模板DNA。通过在94℃变性5分钟然后在92℃，55℃和72℃30个循环的30个循环进行扩增，随后在72℃下最终延伸15分钟，使用PTC-100热循环仪（MJ Research Inc.，Watertown，MA）。 PCR产物在含有溴化乙锭（0.3g·ml-1）的1.0％琼脂糖凝胶中证实；用荧光强度来估计它们的量。

对于DGGE，将等量的PCR产物在0.5 TAE（20mM Tris-HCl，10mM乙酸盐，0.5mM EDTA）中的8％（wt / vol）聚丙烯酰胺凝胶（37.5:1丙烯酰胺：双丙烯酰胺）和变性剂100％变性剂含有7M尿素和40％去离子甲酰胺）。使用从35％到58％变化的梯度来比较社区。较窄的梯度（35％至45％或45％至58％）用于解决推定的双合。在D-Gene装置（Bio-Rad，Hercules，CA）上以20V的恒定电压进行电泳15分钟，接着在200V进行5.5小时。电泳后，凝胶用SYBR green I（Cambrex Bio Science，Rockland，ME）染色，然后用Polaroid照相机（Cambridge，MA）拍照。

统计分析。使用BioNumerics程序（Applied Maths，Belgium）分析PCR-DGGE产生的图谱。在随着时间收集的微观样品的每个指纹之间进行比较。该程序使用基于被比较的指纹配置文件对中每个带的存在或不存在的二进制数据。使用类似的方法（Star Chromatography Workstation software； Varian Inc.）分析磷脂脂肪酸结果。然后使用BioNumerics软件通过主成分分析[36]对基于DGGE带的社区相似性进行量化。

多重PCR。首先使用先前描述的PCR引物和多重PCR方案筛选微量土壤样品中的芳香族氧化酶基因[7]。该方法也用于筛选从微观世界培养出的所有分离物。简言之，使用单独的引物组来扩增萘二加氧酶，甲苯双加氧酶（TOD），甲苯单加氧酶，环羟基化甲苯单加氧酶（RMO），苯酚羟化酶（PHE）和联苯双加氧酶（三种不同的引物组[用于BPH1 ，BPH2和BPH4]）基因。所有的PCR实验都包括来自合适阳性对照菌株的DNA提取物和不含模板的混合物的反应混合物。使用的阳性对照如下： 对于萘双加氧酶，恶臭假单胞菌G7；对于TOD，恶臭假单胞菌F1；用于甲苯单加氧酶，恶臭假单胞菌HS1；对于RMO，铜绿假单胞菌JI104；对于PHE，假单胞菌属。菌株CF600；对于BPH1，睾丸酮丛毛单胞菌B-356；对于BPH2，Pseudomonas pseuodoalcaligenes KF707；对于BPH4，红球菌属。菌株RHA1。通过在含1％琼脂糖凝胶（Bio-Rad，Richmond，CA）中的1L Tris-醋酸盐-EDTA[41]和溴化乙锭（0.3mu;g·ml-1）染色中运行10mu;lPCR混合物来常规显示PCR产物。

用SYBR green I进行实时定量PCR。在初始PCR筛选中检测到的基因通过实时PCR定量，使用在微观实验的第0，16和25天收集的样品。实时PCR在ABI 7700序列检测仪（1.7版软件； Applied Biosystems，Foster City，CA）上进行。定量PCR混合物包含1个克隆的Pfu缓冲液，1U PfuTurbo HotStart DNA聚合酶（Stratagene，La Jolla，CA），0.2mM浓度的每种脱氧核苷三磷酸，SYBR green I（1:30,000； Cambrex Bio Science，Rockland，ME）和为每个引物组优化浓度的MgCl 2。实时PCR的退火和聚合温度，引物浓度和MgCl2浓度与先前描述的相同[5]。在每个实时PCR实验过程中，用标准品

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