湖泊沉积物中微囊藻毒素LR厌氧微生物降解的有效途径外文翻译资料

 2021-12-02 22:33:54

英语原文共 9 页

湖泊沉积物中微囊藻毒素LR厌氧微生物降解的有效途径

摘 要

好氧生物降解微囊藻毒素已经被认为是主要降解藻毒素的方法，但厌氧生物降解的作用目前尚不明确。我们调查了微囊藻毒素的厌氧生物降解潜力及环境因素的影响，在此过程中，利用湖泊沉积物作为接种物进行一系列可控微观实验。发现在滞后期2天后，2天25℃下微囊藻毒素LR可由5 mg /L1缺氧降解至检测限以下。降解速率很高程度上取决于温度，在适宜的温度范围内（20-30℃），添加葡萄糖或低NH4-N水平对微囊藻毒素的缺氧生物降解无影响，而加入NO3-N后，所有实验浓度下生物降解均被显著抑制，且随着NO3-N-amended含量的增加，其抑制作用随之增强。Adda（3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基-癸-4,6-二烯酸），之前报道是微囊藻毒素好氧降解的无毒产物，经鉴定也是厌氧生物降解的产物。这是第一份关于Adda降解微囊藻毒素在缺氧条件下产物的报告。微囊藻毒素的厌氧降解过程中未检测到其他含有Adda残留的产物，这些结果有力的表明，厌氧生物降解是湖泊沉积物中微囊藻毒素去除的有效途径，代表了一个重要的生物修复潜力。

1. 绪论

微囊藻毒素(Microcystins, MCs)是一类以淡水蓝藻为主要来源的环状七肽肝毒素。它们导致野生动物、家畜和水生生物的肝脏衰竭(Carmichael, 2001)。MCs也被认为是接触肝毒素，污染水使人类生病(甚至死亡)的原因(Azevedo等，2002)。已经分离和鉴定了超过70种MC的变体，其中微囊藻毒素LR (microcystin LR, MCLR)是最常见的MCs变体之一。由于水体中的MCs可能对接触过水的人构成潜在的健康风险(Ueno等.， 1996)，科学家和水务部门必须了解MCs的自然降解和消除途径，以降低与这些污染物相关的风险。在自然降解MC水平的5种途径中(稀释、吸附、热分解、pH、光解和生物降解（Tsuji等，2001)，生物降解也许是淡水中MCs最有潜力的消除途径。(Holst等.2003;陈等人.,2008)

MC的好氧生物降解作为MC在环境中主要的衰减机制已被广泛研究。据报道，这一过程发生在各种生态系统中，如污水排放（Lam等，1995），砂滤池（Ho等，2007b），水库（Cousins等，1996; Valeria等，2006），河流（Bourne et al。，2006）和湖泊（Hyenstrand等，2003; Chen等，2008）。降解速率受若干环境因素的影响，如温度（Park等，2001），营养条件（Surono等，2008）和MC预暴露情况（Rapala等，1994; Ho等，2007b）。MC的半衰期通常为数小时至3周（Lam等，1995; Holst等，2003; Ho等，2007b）。目前已经明确了MCLR生物降解的一种途径，该途径由Arg-Adda、Ala-Leu和ada - glu的肽键序列酶法水解，然后生成线性MCLR、四肽和Adda（Harada等，2004; Imanishi等，2005）。三种产品与母体MCLR等相比是无毒的(Bourne等, 1996; Harada等，2004）由此认为好氧生物降解是一种安全实用去除水中MC的方法(Ho等，2007a)

与好氧降解不同，缺氧和厌氧降解一直被认为是MC在环境中微不足道的衰减机制。Holst等人(2003)的研究表明，在硝酸盐还原条件下，MC的厌氧微生物降解能力较强。这一发现表明厌氧降解可能在MC的归趋中扮演着比之前认为的更重要的角色，但到目前为止还没有进一步的研究报告，对这一过程知之甚少。目前尚不清楚厌氧条件下MC生物降解的潜力是否在环境中普遍存在，以及环境因素如何影响厌氧生物降解。在这个过程中产生了哪些产物，这些降解产物是否有毒，目前还不清楚。

本研究以湖泊沉积物为接种物，研究了在厌氧条件下MCLR的降解特性。然后研究了氧含量、温度、改性营养物等环境因素对MC降解的影响。最后，通过电喷雾电离串联质谱(ESI-MS /MS)对降解产物进行分离纯化鉴定。本研究的结果将有助于理解厌氧降解对MC归趋的影响，并进一步了解mc在环境中的自然衰减机制。

2.材料和方法

2.1. 标准和试剂

MCLR标准分析物购自Sigma Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)。从铜绿微囊藻PCC 7806的实验室大规模培养中分离纯化用于生物降解实验的MCLR。分离过程包括用75%甲醇提取培养的蓝细菌细胞，然后通过制备型反相快速色谱和半制备液相色谱进行制备 (LC) (Waters 600, Basking Ridge, NJ, USA)。采用高效液相色谱-二极管阵列检测法(HPLC-DAD)测定得到的MCLR纯度为95%。纯化后的MCLR被浓缩并储存在20℃，从Waters公司（Milford，MA，USA）获得ODS Sep-pak柱。 HPLC级甲醇（Tedia Company，Incorporated，Fairfield，OH，USA）用作HPLC流动相和萃取溶剂。 所有其他化学品均为分析级。

2.2. 沉积物样本

采用在2006年12月用不锈钢抓取采样器从滇池(中国云南昆明)北部富宝湾采集了表层沉积物样本，富宝湾是近20年来蓝藻大量繁殖的地区。这些沉淀物被风干、粉碎，然后过100目筛。使用前将其储存在塑料袋中于4℃下保存。风干沉积物中硝酸盐(NO3-N)和总有机碳(TOC)的含量分别为18.6 mg/g和170.6 mg/g。

2.3.MC生物降解

在一系列用橡胶塞密封的25 ml棕色玻璃瓶中进行了厌氧MC生物降解实验。在每个瓶子中加入沉淀物(0.4 g)和消毒蒸馏水(20 mL)混合，然后加入MCLR，最终得到浓度为5 mg/L。用针将高纯度氮通过水-沉积物混合物冲洗得到厌氧条件，直到溶氧仪(Oxi 315i, WTW, Weilheim, Germany)显示氧饱和度lt; 1%。然后用瓶塞和蜡封住瓶子。在25 C(plusmn;0.5 C)的暗处缺氧条件下孵育，每处理一次，用针和注射器在不同时间间隔从每个瓶中采集0.5 mL混合均匀的样品。室温下10,000 r/min离心15min后，将上清液转移至HPLC自动采样瓶中，测定MCLR及其降解产物的浓度。在取样前和取样过程中，将高纯度氮喷入瓶中以维持缺氧状态。以蒸压沉淀物和水混合为对照检测无生物时降解mc的情况，实验重复进行。

另一种处理方法如下:将装有棉花塞的瓶子置于旋转的浮游生物轮上培养(氧饱和度96%)，进行MC的好氧生物降解;在10、15、20、25、30℃下培养，研究温度对缺氧MC降解的影响;通过添加C6H6O6 (0-1000 mg /L)、NH4Cl(0-1000 mg /L)或NaNO3 (0-1000 mg /L)，研究营养物对MC缺氧生物降解的影响。这些实验采用与之前厌氧实验相同的方案进行，实验参数与之前描述的相同，除了那些规定的参数。

2.4降解产物的分离和纯化

在厌氧生物降解实验中MCLR浓度降至不可检测的水平后，将上清液作为接种物接种到装有50mL无菌矿物盐培养基的瓶子中（每100mL含有：0.06g KH2PO4,0.05g K2HPO4,0.05g MgSO4-7H2O，的0.05g NaCl，0.001g FeSO 4，pH 7.2-7.4），含有纯化的MCLR（10mg/L1）。在用高纯度氮气冲洗以维持厌氧条件后，用塞子密封瓶子并在黑暗中在25℃（plusmn;0.5℃）下在厌氧条件下培养。之后由高效液相色谱分析，一旦MCLR已消失并且存在降解产物，则使溶液通过0.22-mm过滤器过滤。然后将其转入sepp -pak ODS墨盒中(500 mg/6mL)，预先用甲醇和水处理。墨盒用10毫升20%甲醇(v/v)溶液冲洗，用10毫升100%甲醇洗脱。用旋转蒸发器(IKA, Saufen, Germany)将洗脱液浓缩至约1 mL，残渣转移到HPLC小瓶中，用高效液相色谱系统（Milford Waters Alliance 2695）在等浓度条件下，在60%的溶液A（100%甲醇）和40%的溶液B（0.05%三氟乙酸水溶液）中运行20分钟，利用Synergi Hydro RP C18柱（4 mm，250 mm，4.6 mm）进一步纯化生物降解产物。流速为1 ml/min，柱温为保持在30℃下，注射体积为30 ml。将含有降解产物的组分用水分数收集器(Milford)收集，然后浓缩至接近干燥状态。将残余物与10 ml Mill I-Q水重新溶解，并应用于预处理过的sep -pak ODS墨盒中。墨盒用50毫升水清洗，去除三氟乙酸，然后用10毫升100%甲醇洗脱。分析前洗脱液保存于20℃下。

2.5. ESI–MS/MS

使用配备有ESI源并以正离子模式运行的商用LCQ离子阱质谱仪（Thermo Electron Corporation，San Jose，CA，USA）分析MC降解产物。 在60至700的m / z范围内获得光谱。将纯化后的降解产物样品溶解于含0.1%甲酸的50:50水-甲醇溶液中。 然后通过注射泵以5ml / min的流速将其注入ESI源。 ESI条件如下：喷针电压，4.5kV;毛细管电压，45.5V; 毛细管温度，250℃;鞘层气体流量(N2)，20个单位（Thermo Finnigan LCQ）系统中定义的0-100范围内的任意单位的比例）; 和管透镜偏移电压55 V。氦为碰撞气体,以36%的相对碰撞能进行碰撞诱导离解。前体离子的隔离宽度设置为2.0 amu。

2.6. HPLC分析

采用Agilent 1100系统(Santa Clara, CA, USA)进行高效液相色谱分析，该系统由1100型多溶剂输送系统、1100型自动取样器、1100型光电二极管阵列检测器和柱加热模块组成。采用Zorbax 300SB-C18柱(250 mm 4.6 mm, 5 mm, Agilent)和流动相甲醇:0.01% TFA(60:40)，在非均相条件下进行分离。流速为0.8 mL min-1，柱温维持在25℃。通过与MCLR标准样品在238 nm处的峰面积比较，确定了MCLR浓度。降解产物用MCLR当量表示(假设Adda和MCLR具有相同的摩尔吸收系数)。

2.7动力学模型和统计分析

应用Quiroga和Sales (Perales等，1999)提出的动力学模型计算了不同培养条件下MCLR的生物降解速率和半衰期。采用单因素重复测量方差分析(spss 16）确定不同因子水平处理之间是否存在显著差异。如果差异显著，则采用进一步的均值比较(Tukey method)来确定由哪些具体的方法导致了差异，如果plt;=0.05就认为是不显著的。

3.结果

3.1.MC生物降解

在湖泊沉积物作为接种物的情况下，研究了在厌氧和好氧条件下的MC生物降解。 在两种条件下均观察到类似的降解曲线（图1）。在厌氧和需氧条件下，各相分别为2天和3天。 一旦降解开始，MCLR在2天和3天内迅速降解至检测限以下，并且MCLR的半衰期分别为2.7天和3.9天（表1）。 在对照处理中未观察到MCLR的显着降低，表明实验中MCLR的损失不是由于非生物降解。

3.2. 环境因素对缺氧MC生物降解的影响

MCLR的微生物曲线在不同的培养温度显示一个共同的趋势,但温度对MCLR降解速率的强烈影响显而易见(图2,表1)。随着温度从10℃升高到20℃，速率迅速增加。在20℃，25℃和30℃观察到最高速率，但这几个温度之间的差异不显著。mclr在14天内，在10天的滞后期4天内和3天被完全去除和分别在10℃和15℃下，而在20℃到30℃之间的滞后期2天后，MCLR在2天内完全消除。在厌氧条件下，添加葡萄糖(100 - 1000 mg/L)或低浓度NH4-N (NH4Cl 100 mg/L)对MCLR降解没有统计学的显着影响（图3A和B，表1）,在所有实验浓度下，NO3-N添加对MCLR降解具有显着的负面影响，且随着添加1000mg /L的NaNO3，自适应期从对照组的2天延长到9天。（图3C，表1）

3.3. 生物降解产物

采用高效液相色谱法(HPLC)对一种在缺氧条件下培养的生物降解产物进行了研究。该产品的紫外光谱为236nm，与Adda(3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基癸二酸)相似，lmax为236.8 nm (Harada等.，2004)。

将纯化后的降解产物直接注入离子阱串联质谱仪，利用ESI-MS /MS进一步鉴定。如质谱图（图4）所示，产物离子包括前体离子（[Mthorn;H]thorn;m/ z 332），二聚体离子（[2Mthorn;H]thorn;m/ z 663）和其他伴随离子，如[Mthorn;H-NH3]thorn;（m / z 315），[Mthorn;H-NH3-MeOH]thorn;（m / z 283）和[Mthorn;H-NH3-MeOH-H2O]thorn; （m / z 265），与作为MCLR的需氧生物降解产物报道的Adda的ESI-MS谱中的一致（Harada等，2004; Imanishi等，2005）。随后的MS2实验在m / z 663和m / z 332上进行，分别具有105-665Da /扫描和50-335Da /扫描的全扫描（图5）。在m / z 315,283和265处得到的产物离

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