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壳聚糖作为生物活性包衣剂在洋蓟种子保护中的应用
Khalid Ziani a, *, Beatriz Ursuacute;a b, Juan I. Mateacute; a
a 食品科技系，纳瓦拉公立大学，Campus Arrosadia S/N，31006 潘普洛纳，西班牙.
b 拉米罗 阿尔内多,C/杰纳勒尔N.38, 26500 卡拉，西班牙.
摘要：各种病菌的侵害抑制了洋蓟种子的产量。壳聚糖作为抗菌剂能促进洋蓟种子的发芽并提高种子质量。本文研究了各种配方(包括壳聚糖分子量、S-80乳化剂的添加,pH值)，膜的厚度(包衣层数)对洋蓟种子发芽率(%)、真菌活性和植物生长的影响。结果表明，经不同处理的种子发芽率存在显著的差异。实验观察到，所有壳聚糖处理能减少特定真菌的数量并促进植物的生长。低分子量壳聚糖在抑制微生物和促进发芽方面具有良好的效果。此外，含有壳聚糖和福美双的处理组能显著增加洋蓟种子的发芽率，促进植物的生长，同时减少真菌污染。
关键词：壳聚糖；洋蓟种子；抑菌活性；表面活性剂
1、前沿
布兰卡港洋蓟是西班牙北部的主要经济作物，是农产品加工业新的市场。就西班牙而言,每年洋蓟的种植面积达20万公顷。洋蓟种子在萌发过程中易受不同类型真菌的侵害，从而延缓其正常生长发育并大大降低了产量。黑曲霉菌、孢菌和根霉是几种最具破坏性的的真菌。传统的杀菌剂如抑霉唑、苯并噻唑、萎锈灵和福美双已被用来减少种子病原菌。结果表明，使用传统方法能有效减少真菌数量和提高种子质量。然而这些传统抑菌剂在土壤里具有毒性累积，因此从环境因素考虑他们并不是最好的选择。此外,病原菌可能对抑菌剂产生抗药性,这意味着增加使用量才能达到抑菌效果。因此，迫在寻找一种更安全经济环保的替代品。
壳聚糖是甲壳素经脱乙酰作用而制得的衍生物，由beta;（1，4）-2-乙酰胺-2-脱氧-葡萄糖和2-氨基-2-脱氧-葡萄糖构成。它是一种具有抑菌性能的生物聚合物，可有效抑制不同类型的真菌。已有研究报道壳聚糖在种衣剂方面的应用。壳聚糖的抗菌活性与其分子量、脱乙酰度，浓度、脱乙酰基单位的分布类型和真菌的类型密切相关。壳聚糖具有降低或抑制根系腐烂和种子疾病的潜能，已经在番茄、大豆和花生种子包衣处理中得到证实。上述研究表明，壳聚糖是通过诱导植物产生酚酸类物质和植物抗毒素来防止微生物孢子的侵害。
除此以外,壳聚糖可以作为植物激素刺激植物以促进根部木质化。壳聚糖诱导基因产生植物抗毒素作为防御机制。这一作用已经在壳聚糖溶液处理种子过程中得到证实。这种处理方法有助于提高种子的萌发，提高产量。壳聚糖处理包括种子包衣，浸种和叶面喷施。Bhaskara Redd等人发现，壳聚糖能抑制小麦赤霉病菌从而提高小麦种子质量。当壳聚糖浓度为2至8毫克/毫升时能减少50%由禾谷镰刀菌引起的污染，从而提高发芽率和种子活力（壳聚糖浓度高于4毫克/毫升）。马铃薯种子，甜瓜，小麦，黄瓜，番茄，胡萝卜，萝卜和小麦叶片经壳聚糖包衣后，其产量比未包衣的高。小麦和水稻种子用壳聚糖处理后产量能够增长5-20％。此外，还有研究证明马铃薯经壳聚糖处理后每公顷增产11.8％。
本文的主要目的是在第一阶段研究不同壳聚糖处理对微生物的生长，洋蓟种子的发芽和植物生长的影响，以及壳聚糖的分子量、浓度、pH值、表面活性剂的添加以及包衣厚度等因素的影响；第二阶段则评估传统杀菌剂/壳聚糖联合作用的效果。
2材料和方法
2.1材料
两种不同分子量壳聚糖：壳聚糖A（分子量400万）和壳聚糖B（分子量149 万）；醋酸；氢氧化钠；洋蓟种子；福美双。
2.2包衣剂的制备
先将壳聚糖粉末溶解于1％醋酸水溶液中制成3％或4％液体。然后加入 5％的S-80乳化剂作为表面活性剂。用磁力搅拌器以19000转速搅拌10分钟。并用1 N的氢氧化钠调节3％的壳聚糖溶液A的 pH值。然后向100毫升壳聚糖溶液中分别加入1.5、0.75、0.37g福美双，并搅拌10分钟使其混合均匀。
2.3包衣过程
将100克洋蓟种子放入种子包衣机，在包衣机旋转过程中加入10毫升壳聚糖溶液。干燥过程使用传统的干手器以去除溶剂，各处理均重复三次。
2.4包衣外观
使用数码相机以控制和比较种子包衣的外观。图像处理软件使用微孔成像系统。
2.5种子分析
对于每一种子处理，将100颗洋蓟种子放在用400毫升蒸馏水浸湿的虑纸上，放入塑料盒并置于培养箱中，将温度控制在白天30℃，晚上20℃。为了进行同比，设置两个对照组（T0为空白，T1为福美双粉末）。此外，为减少实验误差，所有种子均选自同一批次，所有处理进行三次重复试验。
2.5.1发芽和真菌分析
根据种子测试国际规则（1976），发芽率指测试种子发芽数占测试种子总数百分比。发芽率（％）就是正常发芽种子/总的包衣种子。正常发芽的种子指在适当的环境下可以从胚胎生长发育成植株的种子。根据国际种子测试协会，数据统计分为两个时间周期，即分别在7天和14天后对发芽种子数进行统计。对于真菌的分析，计算了发芽试验期间受到真菌感染的发芽种子数。对真菌的测定包括在种子萌发过程中统计菌丝和孢子数目，并在显微镜下观察孢子和菌体形状。
2.5.2植物生长情况分析
基于7天后幼苗的长度，评估经不同处理后正常发芽种子的生长情况。
2.6实验设计
实验分两部分进行：第一部分，对两个类型的壳聚糖进行研究，评估壳聚糖分子量和浓度，pH值， S-80乳化剂有无及包衣厚度的影响，第一部分实验设计如表1所示。
在第一部分实验结果的基础上，筛选出最佳处理组，并添加不同浓度的福美双。处理时选用新种子，并评估表面活性剂的使用，包衣厚度及福美双浓度的影响作用。在发芽第7天进行抑菌分析。第二部分的实验设计如表2所示。
表1第一部分的实验设计。A：高分子量壳聚糖。B：低分子量壳聚糖。pH由NaOH溶液进行调节。
|
处理 |
壳聚糖 |
壳聚糖浓度/% |
pH |
表面活性剂 |
包衣层数 |
|
T0 |
空白对照 |
||||
|
T1 |
TMTD |
||||
|
T2 |
A |
3 |
4.96 |
无 |
1 |
|
T3 |
A |
3 |
5.60 |
无 |
1 |
|
T4 |
A |
3 |
4.96 |
5% |
1 |
|
T5 |
A |
3 |
4.96 |
5% |
3 |
|
T6 |
B |
3 |
4.96 |
0 |
1 |
|
T7 |
B |
4 |
5.60 |
0 |
1 |
|
T8 |
B |
4 |
5.6 |
5% |
1 |
|
T9 |
B |
4 |
5.6 |
5% |
3 |
表2第二部分的实验设计。
|
处理 |
壳聚糖 |
壳聚糖浓度/% |
pH |
表面活性剂 |
TMTD（质量分数） |
包衣层数 |
|
T0 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
T1 |
- |
- |
- |
- |
0.15 |
- |
|
T2 |
B |
4 |
5.60 |
无 |
0 |
1 |
|
T3 |
B |
4 |
5.60 |
无 |
0 |
3 |
|
T4 |
B |
4 |
5.60 |
5% |
0 |
1 |
|
T5 |
B |
4 |
5.60 |
5% |
0 |
3 |
|
T6 |
B |
4 |
5.60 |
无 |
0.037 |
1 |
|
T7 |
B |
4 |
5.60 |
无 |
0.075 |
1 |
|
T8 |
B |
4 |
5.60 |
无 |
0.15 |
1 |
2,7统计分析
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