羟丙基壳聚糖衍生物的药代动力学和生物降解性能外文翻译资料

 2022-07-22 12:22:14

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羟丙基壳聚糖衍生物的药代动力学和生物降解性能

SHAO Kai, HAN Baoqin*, DONG Wen, SONG Fulai, LIU Weizhi, and LIU Wanshun

海洋生命科学院，中国海洋大学，青岛266003，中华人民共和国

（2014年2月20日接收；2014年4月28日修订；2015年6月6日收录）

copy;中国海洋大学，2015年科学出版社，柏林海德堡斯普林格出版社

摘要

羟丙基壳聚糖（HP-壳聚糖），由于其生物相容性，生物降解性和不同生物活性，具有广阔的应用前景，尤其是在生物医学和医药领域。然而，对其临床应用甚为关键的药代动力学和生物降解性能尚不明确。为了奠定进一步应用和开发的基础，本文进行了荧光强度和凝胶渗析色谱法分析，以确定异硫氰酸荧光素标记的HP-壳聚糖（FITC-HP-壳聚糖）的药代动力学模式及其生物降解性。结果表明，每只大鼠腹腔注射10毫克剂量后，FITC-HP-壳聚糖可以被快速吸收，并通过血液传导到肝，肾，脾。证实FITC-HP-壳聚糖可以有效利用，88.47％的FITC-HP-壳聚糖可在11天内通过尿液排出，分子量小于10千道尔顿。此外，我们的数据表明，肝脏发生明显的降解过程（24小时lt;10 千道尔顿）。总而言之，HP-壳聚糖具有优异的生物利用度和生物降解性，证实了羟丙基改性壳聚糖作为药物传输，组织工程和生物医学领域材料的潜在应用前景。

关键词

羟丙基壳聚糖；异硫氰酸荧光素；药代动力学；生物降解性能; 生物医学材料

1 引言

壳聚糖由 D-葡糖胺和N-乙酰基D-葡糖胺单元组成，是通过壳多糖脱乙酰化形成的氨基阳离子多糖。由于其生物可利用性和生物降解性，壳聚糖已广泛应用于材料，医药，食品和农业等多种领域（Dutta等人，2009年； Honarkar和Barikani，2009年；Pillai 等人，2009年； Carreira 等人，2010年）。然而，壳聚糖在中性溶液中极低的溶解度，极大地限制了其应用（Nishimura等人，1991年；Park等人，2003年）。因此，对壳聚糖以提高其水溶性为目标的化学改性已相继进行（Xie等人，2007年；Dash等人，2011年）。羧甲基壳聚糖（CM-壳聚糖）和HP-壳聚糖是壳聚糖的两个重要衍生物。为了满足不同的应用要求，在CM-壳聚糖和HP-壳聚糖的基础上，进行了多种改性（Rinaudo，2006年；Jayakumar等人，2010年）。壳聚糖的羧甲基衍生物特性已被明确，并应用于药物传输，创面愈合和组织工程（Khor和Lim，2003年；Chien等人，2012年；Shi等人，2012年）。早期研究表明，HP-壳聚糖是一种多功能水溶性壳聚糖衍生物，一旦C-6和C-3的OH基和壳聚糖的NH2基等亲水基被引入（Dong等人，2001年；Peng等人，2005年）。

事实上，在壳聚糖中引入羟丙基，赋予壳聚糖新的特征，如溶解性和保湿能力明显提升（Zhu等人，2001年；Wan等人，2004年；Peng等人，2005年），将其作为生物医学材料，药用辅料和生物活性试剂，扩大应用范围（Xie等人，2002a；Liu 等人，2003年；Prabaharan和Mano，2005）。利用HP-壳聚糖，Wang等人（2010年）开发了一种有效的靶向递送反义寡脱氧核苷酸，发现克服肿瘤耐药性的潜在途径。同时研究表明，接枝的HP-壳聚糖共聚物在30分钟内杀死了99.9％的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，并且由于羟基的引入，超氧化物离子清除能力较高（Xie等人，2002b；Sun等人，2004年）。此外，HP-壳聚糖衍生物已被用作组织工程中间质干细胞角膜内皮重建和粘附支架的复合水凝胶（Gao等人，2008年；Wang等人，2009年；Liang等人，2011年）。近年来，越来越多的实验结果表明CM-壳聚糖和HP-壳聚糖在可吸收生物材料领域的潜在应用和开发利用前景（Ling等人，2008年；Bayramoglu等人，2011年；Riva等人，2011年） 。

体内药代动力学和降解性能是生物材料医学应用的关键。CM-壳聚糖和HP-壳聚糖在体内可以被吸收和分解。因此，CM-壳聚糖和HP-壳聚糖作为生物材料的应用，关键为确定其路线（Ravi Kumar，2000年 ）。为了对改性壳聚糖在体内的药代动力学模式及其生物降解性能有清晰的认识，利用异硫氰酸荧光素进行荧光示踪以及对照。我们先前通过向大鼠腹腔注射异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CM-壳聚糖（FITC-CM-壳聚糖），来研究其组织分布，降解行为和排泄（Dong等人，2010年）。同时比较分子量对FITC-CM-壳聚糖降解性能的影响。结果表明，在大鼠腹腔用药后，分子量对CM-壳聚糖的药代动力学和降解性能有显著影响（Dong等人，2012年）。然而，HP-壳聚糖相关领域尚未得到研究。

在本研究中，首先合成了羟丙基改性壳聚糖，然后通过傅立叶变换红外光谱和1H 核磁共振验证了这种合成。通过大鼠模型的荧光强度和凝胶渗析色谱法分析，计算出了体内分泌和尿液排泄的FITC-HP-壳聚糖分子量。研究了FITC-HP- 壳聚糖的吸收、分布、药物动力学、降解和排泄。此外，还对HP-壳聚糖在腹腔积水、血浆和肝匀浆中的降解性进行了体外评价，以证实其在体内获得的结果。这些研究结果为HP-壳聚糖在药物传输、组织工程及其他生物医学治疗中的进一步开发和应用提供了重要参考。

2材料与方法

2.1 材料

脱乙酰度（DD）为93％，分子量为310千道尔顿（GPC）的壳聚糖由Biotemed 股份有限公司提供（Ghorbani等人，2013年）。葡聚糖标准品从国家药物和生物制品管理研究所购买。青岛药物管理研究所购买斯普拉- 道来氏大鼠（体重200plusmn;10克）。所有其他试剂均采用试剂级。

2.2 HP-壳聚糖的合成

HP-壳聚糖的制备如前所述（Xie等人，2002b；Peng等人，2005年），由壳聚糖和环氧丙烷在碱性条件下进行微量改性。简要过程如下：-20℃下，将壳聚糖（20.0克）加入到40％氢氧化钠溶液（20.0毫升）中进行72小时碱化。接着，将异丙醇（25.0毫升）与碱性壳聚糖混合，连续搅拌2小时，然后加入环氧丙烷（25.0毫升），在45℃下搅拌10小时。最后，混合物用50％盐酸中和，过滤，用95％乙醇纯化，干燥后进一步使用。

2.3 HP-壳聚糖的特征

2.3.1 傅立叶变换红外光谱（FTIR）

为了验证HP壳聚糖的化学结构，在尼科莱特bull;奈克瑟斯-470傅立叶转换红外线光谱仪（美国）上记录了壳聚糖和HP-壳聚糖的傅立叶变换红外光谱。采用KBr方法对Jwstda-32进行数据分析（Sashiwa等人，1990年；Shigemasa等人，1996年）。

2.3.2 1H 核磁共振波谱

为了验证HP壳聚糖的化学结构和计算取代度（DS），在布鲁克DPX300光谱仪（德国）上记录了25℃下壳聚糖和HP-壳聚糖的1 H 核磁共振波谱，分别以丙酮作为内标，1％DC1 D2O， D2O作为溶剂（Zheng等人，2011年）。

2.4 FITC-HP-壳聚糖的制备

FITC-HP-壳聚糖的制备如下：将HP-壳聚糖溶于0.02摩尔L-1 PBS（pH8.0）中，加入异硫氰酸荧光素，混合物在25℃下搅拌24小时。通过透析除去游离异硫氰酸荧光素后，在脱水甲醇中沉淀标记的HP-壳聚糖。然后，将最终的FITC-HP-壳聚糖产物冷冻干燥。为了避免荧光强度的衰减，整个过程在黑暗中进行（Dong等人，2010年）。根据异硫氰酸荧光素和HP-壳聚糖在反应介质中的浓度，测定异硫氰酸荧光素对D-葡糖胺残基的标记率。

2.5动物试验

实验遵照国家卫生研究院，动物的护理和利用相关规范进行。斯普拉- 道来氏大鼠大鼠单独饲养5日，保持在标准实验室条件下，自由获取食物和水。在蒸馏水中加入1毫升FITC-HP-壳聚糖(10 毫克/毫升)，通过腹腔向大鼠注射，将大鼠随机分至代谢笼。在蒸馏水中加入1毫升异硫氰酸荧光素(400微克/毫升) 作为对照。

2.6大鼠体内FITC-HP-壳聚糖的提取

分别在给药后不同时间收集每只大鼠各种组织（肝、肾、脾）和体液（腹水和血浆）中FITC-HP-壳聚糖的样品进行研究。收集至棕色容量瓶中，用蒸馏水将尿液稀释至25毫升体积。然后在4℃下以5000转/分钟离心20分钟，将7毫升尿液上清液在-20℃黑暗处储存。每次测试每组利用4只大鼠，收集组织和体液，并以重量或体积进行定量。用5毫升蒸馏水冲洗腹腔，收集腹腔水肿（1 毫升）。通过腹主动脉法获得血液（1 毫升），并储存在抗凝管（3.8％柠檬酸钠）中。另一方面，称重肝脏，肾脏和脾脏，并将1.0克组织用手握式组织匀浆机（IKA，德国）分别匀化20秒。将所有匀浆和体液样品用蒸馏水稀释至7毫升，然后在4℃下以8000转/分钟离心20分钟，并在-20℃黑暗处储存。

2.7 荧光强度测定

由于异硫氰酸荧光素和FITC-HP-壳聚糖的浓度与荧光强度呈正相关，根据标准曲线确定异硫氰酸荧光素和FITC基的浓度。通过对荧光强度、重量和体积的分析，得到异硫氰酸荧光素和异硫氰酸荧光素标记的HP-壳聚糖在不同组织和体液中的含量。在评价HP-壳聚糖的药代动力学生物学行为时，异硫氰酸荧光素基作为参考物质。该测定在岛津 RF-530PC分光荧光光度计（日本）上进行，激发波长为490纳米，在520纳米处测定强度（Onishi和Machida，1999年； Dong等人，2012年）。所有数据的统计学分析采用单因素方差分析在SPSS上（版本20.0）进行。

2.8 峰值分子量测定

FITC-HP-壳聚糖的峰值分子量（Mp）通过凝胶渗析色谱法，在纯素525系统上利用高效液相色谱法测定，折射和荧光检测器位于520纳米处，激发波长为490纳米。利用两个昭和电工科学株式会社 OHPak SB-806 M柱串联实现分离。在35℃时，流动相为0.02摩尔L-1 PBS（pH8.0），含有0.1摩尔L-1 Na2SO4，流速1.0 mL / min。标准曲线通过分子量为180，2500，10000，41100，133800和2000000道尔顿的葡聚糖标准品测定。数据分析在GPCW32（6.11版本）上进行。根据标准曲线确定所有样品的分子量（Dong等人，2012年）。

2.9 HP-壳聚糖的体外生物降解

对于HP壳聚糖体外降解机理的研究，采用异硫氰酸荧光素作为荧光示踪剂，在凝胶渗析色谱法分析中，克服了体液中自体蛋白质和多糖的干扰。通过创造一个体外模拟腹腔积水，血浆和匀浆的环境，对HP-壳聚糖的生物降解进行了评估。测定如下进行：将FITC-HP-壳聚糖以10mg / mL的浓度溶于生理盐水中。然后将4毫升生理盐水，新鲜腹水，新鲜制备的血浆或肝匀浆分别与盐水溶液中等体积的FITC-HP-壳聚糖混合。在37℃孵育6或24小时后，根据凝胶渗析色谱法分析的标准曲线，测定不同培养基中FITC-HP-壳聚糖的分子量。

3 结果

3.1 HP-壳聚糖的表征

用傅立叶变换红外光谱和1 H核磁共振光谱法，测定了壳聚糖和HP-壳聚糖的化学结构。壳聚糖的傅立叶变换红外光谱光谱（图1a）展示了1030 cm-1（C-O中3-OH的伸缩振动），1160 cm-1（C-O中6-OH的伸缩振动）和1599 cm-1（-NH2）的基本特征吸收峰。而在HP-壳聚糖的傅立叶变换红外光谱中（图1b），壳聚糖的特征吸收峰为1030 cm-1，1160 cm-1和1599 cm-1的峰几乎消失，表明羟丙基化反应发生在 6-OH和3-OH，以及壳聚糖的NH 2基中。 此外，新特征峰出现在2970 cmminus;1和 1376 cmminus;1，这是由于CH3基中C-H的拉伸和弯曲，揭示了壳聚糖的羟丙基化（Peng等人，2005年 ；Prabaharan和Mano，2005年）。

图1壳聚糖（a）和HP-壳聚糖（b）的傅立叶变换红外光谱。

图2展示了壳聚糖和HP-壳聚糖的1 H 核磁共振光谱。壳聚糖的质子分配如下：1.91ppm（CH3，乙酰氨基），3.04ppm（CH，C-2葡糖胺环），3.61ppm（CH，C-2葡糖胺环与取代氨基），3.7 -3.9ppm（CH，C-3,4,5和6的葡萄糖胺环），4.75ppm（CH，C-1葡糖胺环）（Zheng等人，2011年）。 HP-壳聚糖的特征质子分配出现在0.99-1.02ppm（CH3，C-9），表明壳聚糖的羟丙基化（Xie等人，2002b；Peng等人，2005年）。通过1 H 核磁共振分析（Xie等人，2002b；Peng等人，2005）计算出每个糖残基的羟丙基的平均数。 DS值为2.7，由下式计算：

IH9 / IH2-8 = 3DS /(6 3DS) ,成功结合了特征表征以及凝胶渗析色谱法分析，证实分子量为IH9，IH2-8代表C-9和C-2至C-8的氢原子吸收强度（图2）。 HP-壳聚糖约为214千道尔顿。

图2壳聚糖（a）和HP-壳聚糖（b）的1 H核磁共振谱。

3.2 FITC-HP-壳聚糖的标记效率

为了最小化异硫氰酸荧光素和异硫氰酸荧光素基的荧光强度衰减，将所有异硫氰酸荧光素和FITC-HP-壳聚糖样品在-20℃下在黑暗中储存，然后分析。 通过对异硫氰酸荧光素和FITC-HP-壳聚糖标准曲线的分析，得到FITC-HP-壳聚糖的异硫氰酸荧光素含量为4.24％，FITC-HP-壳聚糖的标记效率为1:40，每40个葡糖胺残基中有一个异硫氰酸荧光素结构 。

图3 异硫氰酸荧光素残留（a）和在大鼠腹腔内给药后的每个取样时间点，（b）腹腔积水中异硫氰酸荧光素和FITC-HP-壳聚糖的百分比；平均值plusmn;SD，n = 4。

结果表明，在大鼠腹腔

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