顶空固相微萃取气相色谱/质谱法测定人尿中的邻甲酚和间甲酚外文翻译资料

 2022-08-06 09:29:05

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顶空固相微萃取气相色谱/质谱法测定人尿中的邻甲酚和间甲酚

摘要：邻甲酚(o-C)和间甲酚(m-C)是甲苯的一种微量代谢产物，甲苯是一种广泛应用的具有神经毒性的化学物质。本文提出了一种测定人尿中痕量砷的新方法。尿液甲酚硫酸盐和葡萄糖醛酸盐被提交酸水解，尿液被中和，加入邻甲酚-d8，分析物被使用聚二甲基硅氧烷纤维的SPME在尿液顶空取样。通过GC/MS进行分析，分离使用SupelcoWax10(对于o-C)或手性CP甲酚(对于o-C和m-C)柱。结果表明，该方法的线性范围为0 ~ 5.0mg/l，检出限o-C为0.006mg/l, m-C为0.007 mg/l。该程序适用于从接触甲苯的工人和属于一般人群的受试者的尿甲酚的定量。

关键词：尿甲酚；生物监测；职业甲苯暴露

简介

甲苯是一种非常常见的化学物质，被广泛用作油漆、涂料和许多消费产品的溶剂，合成中间体和燃料添加剂，以提高汽油辛烷值[1]。人类在工作环境和生活环境中可能接触到甲苯，甲苯是香烟烟雾、汽车尾气、汽油和各种商品蒸汽的组成部分。由于其对中枢神经系统的毒性，甲苯暴露在许多国家都受到管制。不同国家的工业卫生协会和/或政府机构建议、建议或建立了50 ppm (188 mg/m3)的空气浓度作为工作班次期间的职业接触限值。

人体接触后，甲苯容易转化为多种代谢产物，其中邻甲酚(o-C)、间甲酚(m-C)和对甲酚(p-C)三种异构体。这些化合物以葡糖苷酸和硫酸酯缀合物的形式随尿液排出，占吸入剂量的百分比很少。生物监测的职业接触甲苯、o-C在尿液采用行列式在生物曝光指数(贝)列表由美国政府工业卫生会议(工作者)[2]和职业暴露在生物公差值(BAT)列表由德国就业和社会事务部(AGS委员会有害物质)[3]。移动结束时采集的样本，建议取0.5 mg/l作为BEI，移动结束时采集的样本，经过长期暴露后，建议取3.0 mg/l的BAT。ACGIH报告的“B”标记表明o-C通常存在于大量从未被职业暴露的受试者采集的生物标本中。

尿中微量元素的使用也从未被调查过。相反，无论其职业性接触甲苯，所有研究对象的尿液中都含有大量的这种化学物质。

到目前为止，已经发表了几种测定尿氧嘧啶的分析方法，其中一些方法通过流动或固定手性相进行分离，也适用于m-C。在偶联物水解后，通常需要进行样品制备，使用有机溶剂、蒸汽蒸馏或使用C18反相二氧化硅的固相萃取尿液中的游离甲酚。也建议对意外或故意摄入的生物液体中存在的游离甲酚进行直接顶空取样。然而，由于甲酚在水中的高溶解度，溶剂萃取过程可能很难有效，蒸汽流蒸馏需要大的样品体积，可能精度较差和/或由于使用相对较大的蒸馏设备，分析物的损失受到影响。HPLC和GC等技术用于甲酚类化合物的分离，紫外检测器和FID检测器传统上用于它们的定量。氟化或荧光化学衍生化的引入，以及ECD或荧光计的结果检测，以及MS检测器的使用，已经将分析技术的检测限降低到很少微克每升，允许测定尿甲酚也在非职业暴露的受试者。

本文提出了一种适用于测定人尿中低浓度甲酚的改进分析方法。该测定是基于游离甲酚的挥发性，在水解它们的共轭物后，用SPME在尿液的顶空(HS)中取样，并直接注射到适当的毛细管柱上进行分离。该方法使用少量样品，在一个小瓶中完成所有步骤，引入内标，避免使用溶剂，大大减少了人工操作，自动提取和注入色谱系统中的分析物。通过GC/MS进行分析，确保了在分离和鉴定分析物时良好和持久的性能和高特异性。提出了两种毛细管色谱柱:一种是快速分离o-C，另一种是用手性固定相分离o-C和m-C。本文报道了该方法在照相凹版印刷工人和普通人群中测定氧碳和氧碳的应用。

实验

    1. 实验品和标准制备

标准制剂采用O-C(99% )(Sigma-Aldrich)、m-C(99%)和p-C(99%)(Fluka)。以O-甲酚-d8(98at.%D，Sigma-Aldrich)为内标。从Carlo Erba Reagenti购买盐酸水溶液(HCl，37%，w/w)、氢氧化钠(NaOH)、氯化钠(NaCl)、乙酸钠、醋酸和甲醇，纯度ge;99%。用醋酸和乙酸钠在pH4.6的水中配制1M缓冲溶液。用97%的苯酚-D-葡萄糖醛酸(Sigma-Aldrich)评价酸水解效率。在尿液中各化学物质浓度分别为5.0、2.5、1.2、0.6、0.12、0.0 6、0.012、0.006 mg/l时，配制o-C、m-C标准溶液。同一尿液的未添加样本被保留为空白。用于制备这些溶液的尿液是不吸烟的捐赠者的尿液池，没有职业接触甲苯。以邻甲酚-d8为内标配制了浓度为5.63 mg/l的水溶液。将甲酚标准溶液和内标溶液分成小份(约1.2ml)，在-20◦C黑暗中保存。

    1. 设备

样品制备和分析采用2ml自动进样器玻璃瓶和硅橡胶聚全氟乙烯垫片(Kimble)组成的气密性容器，玻璃瓶用螺杆开顶式封闭器密封，密闭容器由2ml自动进样器和硅橡胶聚全氟乙烯垫片(Kimble)组成。采用膜厚为100m的聚二甲基硅氧烷(PDMS)、膜厚为65m的聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)、膜厚为65m的碳氧烷/二乙烯苯(CW/DVB)和膜厚为85m的聚丙烯酸酯(PA)的固相微萃取装置和纤维在顶空样品(Supelco)中进行分析。安捷伦公司生产的5890II系列气相色谱仪与5972质量选择检测器接口，工作在电子轰击(EI，70 eV)模式。注射使用SPME设备，使用8200CX系列自动进样器(Varian)和搅拌系统。分体式/无分体式喷油器在无分体式模式下工作，配备了用于SPME(I.D.)的进气衬套。0.75 mm，Supelco)。色谱柱为SupelcoWax10毛细管柱(30m长，0.25mmi.d，0.25m膜厚，Supelco)或CP-Cresol毛细管柱(50m长，0.25 mm内径)。和0.20m薄膜厚度，瓦里安)。

    1. 气相色谱/质谱法

将含有甲酚并-甲酚-d8的混合物从进样口的固相微萃取纤维上热脱附至色谱柱，保持在250◦C。根据色谱柱的不同，采用两种色谱条件。两种情况下载气均为氦气1ml/min，流量恒定。对于SupelcoWax10，将烤箱温度保持在140min，然后以25◦C/ min的速度将温度提高到225◦C。以225◦C下保温2.5min，然后以25◦C/分钟的速率再次升温至250◦C，并在此温度下保持1分钟。总运行时间为15min。在此条件下，o-C的保留时间为11.51min，p-C和m-C的保留时间分别为12.12和12.17min，邻甲酚-d8的保留时间为11.47min。对于对甲酚色谱柱，烘箱温度保持在50◦C下8min，然后以25◦C/◦的速度升温至120min。最后将温度保持在120◦C 40min。总运行时间为51min。在此条件下，o-C的保留时间约为40.33min，p-C的保留时间约为47.52min，m-C的保留时间约为49.27min，邻甲酚-d8的保留时间约为39.69min。源温度为178◦C的MS探测器在选定的离子监测模式下采集信号。停留时间为100ms。为了获得质谱，扫描了m/z 40-200的离子范围。对于甲酚和邻甲酚-d8，光谱仪分别聚焦在离子m/z [CH3C6H4OH]bull; 和115[CD3C6D4OH]· 。

    1. HS SPME

为了确定最方便的HS SPME实验条件，对以下参数进行了考察：不同的纤维涂层，在被分析物溶液中加入饱和量的盐，采样过程中的搅拌，采样时间，解吸时间。插入气密瓶中并在室温下保存(sim;25◦C)。最后，一旦确定了HS SPME的总体条件，就对提取过程的回收率进行了评估。

2.4.1不同SPME纤维涂层的对比评价

比较了PdMS，250◦C；PdMS/DVB，250◦C；CW/DVB，240◦C；PA，250◦C；固相微萃取可以在平衡状态下进行，也可以在较短的时间内进行。当涂层通过吸附(PDMS/DVB和CV/DVB纤维)而不是通过吸附(PDMS和PA纤维)取样时，第二种模式更可取。事实上，对于纤维吸附取样，在平衡状态下，生物流体中其他更丰富的化学物质可能会引起分析物的竞争性置换。

2.4.2加盐和搅拌的效果

另外，还分别评价了在取样过程中加入饱和氯化钠和搅拌的效果。在每个小瓶中加入300毫克的氯化钠即可达到饱和。采用与自动进样器配套的搅拌器对固相微萃取纤维进行自动搅拌，在以下条件下传输：聚二甲基硅氧烷纤维，取样时间20min，解吸时间8min，解吸温度250◦C。

2.4.3采样和解吸时间

利用聚偏二甲基硅氧烷(PDMS)纤维，研究了HS SPME吸附尿液中甲酚和热解吸分析物的动力学。对于解吸，在250◦C下进行，时间从3到15分钟不等。

2.4.4还原

在优化的HS SMPE条件下对o-C和m-C的回收率进行了评估。在本试验中，从0.3ml标准溶液中以0.600 mg/l(每种甲酚180 ng)获得的色谱信号与直接注入等量分析物在0.51微克甲醇中获得的色谱信号进行了比较。对于液体进样，色谱条件如上所述，除了入口内径为4.0 mm的衬垫(苏佩尔科)被使用[26].

    1. 甲酚偶合物的水解

为了确定在37%(w/w)的盐酸水溶液中进行甲酚酯水解的最方便条件，对以下参数进行了评估：反应时间、反应物的量、水解过程中样品中氯化钠的饱和量的影响。进一步的实验确定了水解后反应介质的中和和缓冲条件。为了优化反应时间和反应物的量，由于缺乏工业标准的共轭甲酚，采用苯酚-D-葡萄糖醛酸作为替代。在其他测试中，使用的是职业暴露受试者的尿液。最佳反应时间，即完成水解所需的最短时间，用0.5ml苯酚-d-葡萄糖醛酸酐0.5ml在水中与50ml盐酸在100min的温度下反应5~90min为最佳反应条件。将水解苯酚的色谱信号与相同浓度的游离苯酚水溶液的色谱信号进行了比较。评估了完成水解所需的最小盐酸用量，并在不同体积的酸(从40到80微升)中进行反应。

    1. 样品制备

尿样放在室温下，直到完全解冻。摇匀等待几分钟后，将0.3ml尿液转移到2ml玻璃小瓶中，内含300 mg氯化钠，加入50ml 37%盐酸水溶液，并易于密封。将混合物猛烈摇动，甲酚结合物在100◦C下水解60min。在室温下冷却15min然后在-20◦C下冷冻90分钟。冷藏样品依次加入50L氢氧化钠10M、300L醋酸/醋酸缓冲液1M和50L内标液。样品在室温下放入自动进样器托盘中进行分析。使用配备PDMS光纤的SPME装置采集尿液顶空中的O-C和MC。采样在室温下进行20min。分析物的进样是通过SPME纤维在GC进气口的热解吸在无分裂模式下进行的。在250◦C下解吸8min。分析分离由GC/MS在上述条件下完成(见第2.3节)。

    1. 线性、检出限、批内和批间精密度、准确度加成反应

对于校准曲线，采用上述程序对尿液中o-C和m-C的校准溶液(浓度范围分别为0.006~5 mg/l)和2.1.1节中制备的尿液空白进行一式三份的分析。用最小二乘线性回归分析估计函数y=mx q的斜率(M)和截距(Q)，其中y是o-C或m-C的色谱峰面积与o-甲酚-d8的比值，x是样品中o-C或m-C的浓度(mg/l)。根据表达式计算每种成分的检测限(LOD)。

其中SEQ是截距的标准误差[27]。使用SupelcoWax10和CP Cresol色谱柱，通过分析三个尿液中同时添加了已知的o-C和m-C浓度(理论上分别为0

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