功能化聚乙二醇制备生物相关结合物外文翻译资料

 2022-08-07 14:18:21

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功能化聚乙二醇制备生物相关结合物

萨缪尔·扎利普斯基*

脂质体技术公司，加利福尼亚州门洛帕克汉960号密尔顿法院94025。1994年8月29日收到。

序言

聚乙二醇是最好的生物相容聚合物之一，具有一系列有用的特性（1，2）。其中包括在有机和水溶液中广泛的溶解性（2，3），缺乏毒性和免疫原性（4），非生物降解性，以及易于被活生物体排泄（5）。在过去二十年中，聚乙二醇被广泛用作各种共价底物修饰剂，产生具有起始底物和聚合物的某些性质的共轭物（6）。聚乙二醇改进的底物包括低分子量化合物、几乎所有种类的生物大分子以及微粒和人工材料的表面（见表1）。这一领域的绝大多数工作都是为了改变所需底物的一个或多个性质，使其适合（或更适合）特定的生物应用。这通常包括改善溶解度性质，增加分子量，或改变基质在两相体系中的分配性质。然而，随着聚乙二醇共轭物的种类和应用的增加，通过聚乙二醇的共价修饰可以将各种生物识别机制在体内引发的许多不良效应降到最低。例如，蛋白质的免疫原性和抗原性可以降低（4，27）。脂质体、纳米粒和蛋白质的血液寿命可显著延长，网状内皮系统（RES）器官、肝脏和脾脏对能量的摄取减少（25）。在移植聚乙二醇表面的情况下，可降低血栓形成性、细胞和蛋白质粘附性（26）。聚乙二醇所传递的这些有益性质对于任何需要血液接触的系统都是非常重要的。特定聚乙二醇共轭物的一些性质及其应用已成为单独综述的主题（4、12、13、15-19、25、26）。

与此相反，本文综述了聚乙二醇的功能化衍生物及其合成和应用。虽然这篇综述相当全面，但这里重点介绍了最好的聚乙二醇功能化方法，特别注意它们与各种生物结合应用的相关性。本文的目的还在于总结自以前的评论发表以来该领域的重要最新发展，这些评论的范围有些重叠（9，28，29）。

聚乙二醇功能化与共轭的综合思考

聚乙二醇是具有一般结构HO- (CH2CH2O)n-CH2CH2-0H (1).的聚醚二醇。它们有多种分子量和低分散性（Mw/Mnle;1.1）。虽然聚醚主链具有相当的化学惰性，但初级羟基可用于衍生化。通常用于制备生物结合物的聚乙二醇的分子量在1000到20000 Da之间变化，尽管在某些情况下使用了比此范围内分子量更高或更低的聚合物。分子量的选择通常取决于特定共轭物的预期用途。聚乙二醇单甲醚（mPEG）也经常用于制备各种共轭物，特别是当需要将聚合物的多个链连接到预期的底物时。在聚乙二醇单甲醚上仅存在一个可衍生的端基最小化了交联的可能性并改善了此类制剂的均匀性。因此，一些类型的结合物（例如，来源于蛋白质、脂质、生物材料表面衍生的）几乎完全使用聚乙二醇单甲醚作为起始材料来制备。

在少数情况下，生物相关分子与聚乙二醇结合是利用商业上可获得的聚合物的终端初级羟基的反应活性直接实现的。描述了制备含有醚（30，31）、酯（7，32-34）或碳酸盐（35）键的各种共轭物的实例。与含羧酸的分子形成酯是一个特别干净的反应，可以在非常温和的条件下完成（36）。然而，在大多数情况下，聚合物的适当功能化是通向最终共轭物的第一步。在生物学文献中，这个过程通常被称为聚合物的“活化”。

由于在许多情况下，很难将所需的聚乙二醇功能化分子与发生副反应或未能反应的同一聚合物分离，因此，使用清洁、定量的反应在聚合物上转化官能团是很重要的。在某些情况下，当聚乙二醇上没有外来反应基团，且过量的未反应聚合物可在“激活”过程中容易地与最终共轭物分离，不必完全需要对官能团进行清洁和定量的转换。通常情况下，聚乙二醇蛋白结合物可以根据其大小、电荷或疏水性从聚乙二醇试剂中分离出来。功能化和共轭策略往往受到最终产品的预期使用的影响。例如，对于亲和两相分配和生物反应器应用（见表1），实现端基团与配体分子完全取代并不重要。通常也可以容忍未反应聚乙二醇对共轭物的污染。另一方面，共轭物的组分之间的联系性质及其稳定性可能至关重要。纯度和均匀性的最严格要求适用于拟用作聚合物药物的共轭物。由于生物活性和/或功效的演示是一项非常微妙的任务，它可能会受到微小杂质的影响，因此，避免包括未反应或部分反应的聚乙二醇衍生物（7、9）的任何类型的污染是很重要的。

制备与聚乙二醇有关的预成型聚合物功能衍生物的主要方法有两种：（1）羟基直接转化为新的目标功能团；（2）聚合物与双功能分子的反应，使一种功能团与聚合物形成连接，另一种功能团保持不变可用于进一步的化学转化。这两种方法都经常使用，而且每个方法都有其优点，在规划特定的共轭策略时应考虑这两种方法。首先，讨论了聚乙二醇在生物吸附工艺中最常见、最通用的衍生物或作为制备其他功能化聚乙二醇的中间体。

具有广泛用途的功能化衍生物

聚乙二醇的卤代衍生物。通过分别用亚硫酰氯（7，37，38）或溴化物（39）处理，很容易将末端羟基转化为氯化物或溴化物衍生物。已知这些变换是定量进行的。氯-和溴-聚乙二醇（2a，2b）通常用作进一步转化官能团的中间衍生物（方案1）。

方案1.通向聚乙二醇卤代、对甲苯磺酸盐和氨基衍生物的常用合成途径

聚乙二醇磺酸酯。聚乙二醇的伯羟基与有机磺酰氯的反应被广泛用作在聚合物末端留下易离去基团残基，并作为聚乙二醇羟基（40-45）卤化的替代物。磺酸盐酯通常比卤化物更具活性，并且通常用作制备各种功能化聚乙二醇（氨基（40，42）、硫醇（45）、苯乙二醛（46）和苯甲醛（47））的方便起始材料。对甲苯磺酸聚乙二醇（3）是最常用的磺酸盐。该衍生物合成过程的几个变化声称提供了官能团的完全转换（42-45）。然而，对甲苯磺酰氯和聚乙二醇羟基之间看似简单的反应并不总是没有麻烦的。许多作者注意到的一些副反应涉及聚乙二醇链降解（41）和PEG-C1的形成（45）。另据报道，聚乙二醇（3）的对甲苯磺酰化物除了能够进行水解外，还容易受到末端（48）6位氧的亲核置换。这一过程可导致二氧六环和聚乙二醇的形成被两个环氧乙烷单元缩短。Harris及其同事提倡聚乙二醇的甲基磺酸盐（甲磺酸）酯作为对甲苯磺酸酯的有用替代衍生物（41）。虽然比甲苯磺酰化物反应性小，但长期贮存稳定，易于制备。通过胆固醇醇盐（31）亲核取代甲磺酸制备具有生物活性的聚乙二醇单甲醚-胆固醇结合物。

Nilsson和Mosbach（49）引入聚乙二醇的树酯（2,2,2-三氟乙烷磺酸盐）作为蛋白质修饰试剂。聚乙二醇-树酯对亲核试剂的反应性比对甲苯磺酰基高约2个数量级，对蛋白质的氨基反应缓慢。几个研究小组使用聚乙二醇树酯修饰各种蛋白质（50-52）。烷基化反应主要发生在蛋白质的氨基上（如果存在硫醇，也会发生反应），并导致聚乙二醇和多肽底物之间形成仲胺键。甲酰聚乙二醇还用于连接配体，如三磷酸腺苷（53）和纳洛酮（54），以用于蛋白质生物结合化学的聚乙二醇。制备聚乙二醇单甲醚接枝脂质体也可通过直接聚乙二醇单甲醚-三酰化反应与含聚乙烯的脂质体（55）或通过先合成聚乙二醇单甲醚聚乙烯，然后形成脂质体（56）来实现。玻璃固定化聚乙二醇-树酯被证明对蛋白质共价连接有用（57）。

氨基聚乙二醇。与端羟基聚乙二醇相比，伯氨基聚乙二醇（4）在亲核取代反应中具有更高的反应活性，是制备各种生物结合物的一种广泛应用的衍生物。低分子量药物、辅助因子和其他配体（8，58-61）、肽（62）、糖蛋白（63）和生物材料表面（64，65）通过酰胺、仲胺、尿素、硫脲和氨基甲酸乙酯与氨基聚乙二醇相连，所有这些都是稳定的体内连接。发现与伯氨基聚乙二醇形成酰胺键是一个特别有用的反应，可以在非常温和的条件下完成（3）。例如，通过用各种杂双功能试剂（66-70）处理伯氨基聚乙二醇，将几种有用的官能团引入聚乙二醇。

几种公开的方法可以制备带有伯氨基的聚乙二醇。所有这些步骤都涉及两个或多个合成步骤（方案1）。合成氨基聚乙二醇（4a）最直接的方法之一是首先将羟基转化为卤化物（2a或2b）或磺酰基酯（对甲苯磺酸或甲磺酸），然后与过量的氨（37、39、71、72）反应。许多作者在实验条件的一些变化中成功地使用了这一主要方法。该工艺经过优化，以产生官能团的定量转化，并适用于大规模实验室制备（37）。这种制备伯胺的简单方法的主要缺点是副产物仲胺的形成。对于高分子量的聚乙二醇衍生物来说，这似乎是一个小问题。然而，这种副反应的程度可能取决于聚乙二醇的分子量以及反应条件。因此，用凝胶渗透色谱法检查产品是否存在交联聚乙二醇是需要的。Leonard和Dellacherie研究了用凝胶渗透色谱法（72）将分子量为5000的聚氯乙二醇单甲醚转化为其氨基衍生物。他们发现，由于聚乙二醇单甲醚氨基的形成，产物中分子量为10000的物种数量增加。在作者使用的条件下，高达28%的氯端基发生交联生成聚乙二醇单甲醚氨基。

Mutter及其同事使用了聚乙二醇上伯胺端基的Gabriel样合成（40）。反应顺序包括将最初存在的OH基团（1）转化为对甲苯磺酸酯（3），然后用邻苯二甲酰亚胺钾亲核取代甲苯磺酰基，最后对邻苯二甲酰亚胺端基进行肼解（方案1）。这种途径不允许仲胺的形成。不幸的是，公布的程序只产生约等于80%的羟基转化为胺（4a）。未报告剩余的约等于20%终末组成是什么。

当端基定量转化为伯胺很重要时，建议遵循一系列的反应顺序，包括转化为卤化物，用叠氮化物置换卤化物，最后将叠氮化物基团还原为伯胺（方案1）（73）。很明显，这种合成途径形成的伯胺不能被仲胺污染。Zalipsky等人（7）研究了这三个步骤中的每一个步骤，并证明这三个步骤都已完成。

上述三种方法都是通过直接将羟基转化为伯胺的方法在聚乙二醇（4a）上生成末端氨基乙氧基。用不同的双功能试剂封端聚合物，制备了几种有效的引入氨基的方法。例如，聚乙二醇醇盐与2-溴乙基邻苯二甲酰亚胺之间的反应以及所得邻苯二甲酰亚胺-聚乙二醇的氢化反应导致氨基乙基附着到聚合物上。Geckeler（74）描述了上述Gabriel合成的这种改变，其端基总转化率约等于90%。Schacht及其同事通过使聚合物的硝基苯碳酸酯衍生物与2-（三酰氨基）乙胺反应，然后酸解去除三酰保护基（71），将氨基乙酯残基连接到聚乙二醇上。类似结构的聚合胺可以通过聚乙二醇羟基与羰基二咪唑反应然后过量的乙二胺（75）在一锅法中制备。通过这两种方法将羟基端基转化为伯胺基本上是定量的。氨基乙醇酸钾和聚乙二醇磺酸酯（3）之间的反应提供了将伯氨基引入聚合物（4b）（42）的另一种方法。通过这种途径，官能团的转化率通常高于90%。

聚乙二醇羟基与氨基酸的酯化反应为末端氨基基团的引入提供了另一种途径。这种氨基酸酯被用作液相肽合成的起始原料（3）。研究表明，DMAP催化的碳二亚胺活化的NMiert丁氧基羰基保护氨基酸的附着在非常温和的条件下进行定量（36）。酸解去除保护基暴露出适合各种共轭反应的伯胺。氨基酯（pKaasymp;7-8）的碱度一般低于上述氨基乙基的碱度。这可能提高在中性或弱酸性水介质中进行的各种共轭反应的效率。人们还必须记住酯键在水溶液中的潜在不稳定性，这可能对某些应用有用，而对其他应用有害。水解敏感性取决于聚乙二醇的分子量、氨基酸残基、pH值和温度。例如，有人观察到，除了少数例外，大多数通过将氨基酸残基逐步添加到聚乙二醇氨基酸酯上而组装的肽序列可以在弱碱性条件下从聚合物载体上分离（3）。通过酯交换、肼解或氨解等方法从聚乙二醇中分离出一些抗水解的聚乙二醇肽。

芳香胺的pKa值（范围从3到6）甚至低于氨基酸的氨基。这些衍生物是通过对硝基苄基溴与醇钾聚乙二醇反应，然后还原硝基（76）来制备的。或者，聚乙二醇与对硝基苯甲酰氯酯化，然后用连二亚硫酸钠还原硝基（14）。Weber和Stadler（77）描述了聚乙二醇羟基到4-氨基苯烯-聚乙二醇的定量转化，尽管是在剧烈的反应条件下。该合成涉及K2CO3介导的对硝基氟苯与聚乙二醇羟基的偶联，以及使用N2H2/Pd/C还原硝基。除了脂肪族胺特有的烷基化和酰化反应外，芳香族胺还可以通过亚硝酸盐处理容易地转化为重氮盐，并通过重氮偶联用于共轭反应。这种共轭模式被用于对氨基苯甲酸-聚乙二醇与5-磷酸吡哆醇的连接，产生聚乙二醇连接的辅助反应器，用于生物反应器（14）。

方案2.聚乙二醇酰肼衍生物的制备

酰肼聚乙二醇。在各种生物结合方案中最通用的功能之一是肼基。酰肼与含醛化合物形成相对稳定的腙的能力对于糖蛋白的位点特异性修饰特别有用。

Andresz等人描述了羧甲基化聚乙二醇的酯基的肼解作用，如方案2（21）所示，通过使聚合物的醇盐与卤代乙酸酯反应可容易获得。反应生成了具有几乎理论含量的活性基团的聚酰肼（5a）。使用酰肼（5a）与葡萄糖和麦芽糖低聚物的醛基形成肼。所得的结合物用与碳水化合残留物的酶促延伸。

聚乙二醇-三酰甘油酯与过量己二酸二酰肼的反应也用于将酰肼基团引入聚合物（53）。所得的己二酰二肼聚乙二醇用于高碘酸氧化羟基三磷酸腺苷的附着。聚合物酰肼的官能团含量未见报道。然而，聚乙二醇结合物中的低羟基三磷酸腺苷含量（0.06 mol/mol 聚乙二醇）表明己二酰二酰肼聚乙二醇中的酰肼含量也可能较低。

在专利文献（78）中描述了氨基甲酸乙酯连接beta;-丙氨酸酰肼（5b）的制备。该合成首先涉及将beta;-丙氨酸乙酯偶联到聚乙二醇单甲醚氯甲酸盐，然后进行肼解（方案2）。通过对酰肼基的量热分析和氨基酸分析测定beta;-丙氨酸含量，确定了通过这一反应序列进行的官能团转换是定量的。氨基甲酸丁酯与聚乙二醇上的羧基偶联，然后酸解去除叔丁氧基羰基保护基，是制备聚乙二醇酰肼的另一个更温和的途径（79，80）。通过将聚乙二醇单甲醚-beta;-丙氨酸酰肼（5b）与碳二亚胺活化的羧基偶联，在保持赖氨酸残基不反应的酸性条件下形成二酰肼键，证明了肼-聚乙二醇作为蛋白质修饰剂的效用（78）。通过高碘酸盐氧化，然后与聚乙二醇单甲醚-beta;-丙氨酸酰肼发生腙形成反应，对糖蛋白的寡糖残基进行了位点特异性修饰。在这两种结合方式中，通过氨基酸分析（78）对其水解物中的beta;-丙氨酸进行定量来确定修饰蛋白质的组成。

酰肼作为伯胺类亲核试剂，能很容易地转化为酰基叠氮化物，这是一种具有活性的酰基官能团。该反应在几项专利中被描述为一种原位聚乙二醇单

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