新型水凝胶——氧化魔芋葡甘聚糖交联壳聚糖的制备与性能研究以及体外载药外文翻译资料

 2022-09-30 11:29:14

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新型水凝胶——氧化魔芋葡甘聚糖交联壳聚糖的制备与性能研究以及体外载药

摘要：在本论文中，新型复合水凝胶是以双醛魔芋葡甘聚糖（DAK）作为大分子交联剂与

壳聚糖（CS）进行交联制得的。这种生物相容性良好的材料能在几分钟内交联和凝胶，并且通过各种分析方法表征出它的结构和形态。结果表明，这种水凝胶是通过CS上的氨基基团与DAK上的醛基基团发生希夫碱反应形成的。当水凝胶中DAK含量提高时，交联密度（）会随之增加，而平衡溶胀比（SR）和交联平均分子量()将会减小。药物释放是通过改变释放介质的PH值从而使水凝胶平衡溶胀比发生变化，导致释放速率的改变，进而评估的。这表明药物释放可能会受到药物与聚合物之间的相互作用的阻碍。更为重要的是，通过与以小分子作为交联剂的传统制备方法相比较，这个提供了一个全新的材料制备思路。

简介

水凝胶作为一个重要的生物材料，已经引起了广泛的关注，因为其具有广泛的医药和生物应用，如隐形眼镜，伤口敷料，人造器官，生物活性试剂的输送载体。到目前为止，已经报到出很多具有优良特性的、由合成的或者天然的原料制成的水凝胶。天然聚合物是从活的生物体上获得的，来源广泛。相比起各种合成材料，天然聚合物具有良好的生物相容性、生物降解性、无毒性，和易于改性的特性。越来越多的研究者集中在以天然高分子水凝胶作为药物载体的研究上，包括多糖，纤维素衍生物和蛋白质。而以来自于海洋的壳聚糖和由n-葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺构成天然衍生的多糖为原料制备出的水凝胶就是天然高分水凝胶中的一种。因为其作为一种生物材料具有成本低，应用广泛，抗微生物活性以及生物相容性良好的特性，所以在不同组织工程中得到应用，并且已获得了广泛的关注。纯壳聚糖十分脆弱，而且在PH=6的溶液中容易通过氨基的质子化作用而溶解，也因此限制了它的应用范围。为了使壳聚糖能广泛应用，已经发展出各种各样的物理和化学方法，并且制备出很多以壳聚糖材料，包括壳聚糖膜、壳聚糖海绵、壳聚糖珠子、壳聚糖水凝胶、壳聚糖纳米颗粒等。然而，为了使壳聚糖水凝胶材料结构完整，交联过程是必不可少的。目前，在各种各样壳聚糖生物材料的配方中，戊二醛和甲醛是最常用的交联剂。但是这些材料包含一些复杂的化学成分，而这正是明文标识的细胞毒素，这也成为了这些材料在体外和体内应用的障碍。因此，为了人身安全利益着想，开发一种毒性小的、用于壳聚糖生物材料的交联剂十分重要。在这篇论文中，我们致力于通过魔芋葡甘聚糖开发出一种新型的大分子交联剂，并且制备出复合水凝胶药物载体。魔芋葡甘聚糖是水溶性、非离子型高分子天然多糖。由于它良好的生物相容性，生物降解性以及优异的凝胶特性，近些年来，KGM作为生物医用材料在控制释放系统中已经展现出良好的前景。它是一种线性随机共聚物，它的beta;-（1,4）位置上D-甘露糖和D-葡萄糖连接，摩尔比为1.6:1，大约有1/19乙酰化。由于在beta;-（1,4）键上连接有多糖，魔芋葡甘聚糖可以与高碘酸钠发生氧化反应。同时KGM分子链上的碳碳双键裂解生成具有反应活性的醛基，该基团可以与蛋白质、明胶、壳聚糖以及其他一些药物，其具有脂肪族氨基官能团或者重要的氨基基团，能够在游离氨基基团与氧化多糖上的醛基基团之间形成亚胺键或者席夫关系。

目前，有一些多糖如葡聚糖、阿拉伯树胶和硫化软骨素被部分氧化，并且在已经发表的文献中也描述了可能的医疗应用。然而，很少有报道使用氧化魔芋葡甘聚糖为交联剂，制备

水凝胶药物载体。所以，使用高碘酸盐氧化魔芋葡甘聚糖不仅仅提供了一个方便的路线合成作为药物载体的壳聚糖-氧化魔芋葡甘聚糖水凝胶，同时也有助于拓宽魔芋葡甘露聚糖的应用范围。这项工作的目的是制备在不同比例情况下的、无毒的、可生物降解的CS-

氧化魔芋葡甘聚糖水凝胶，然后研究它们物理、化学、机械、形态特性以及体外药物释放行为。这些特性的评估能够提供一些有用信息，从而了解水凝胶的形成机理以及药物释放动力学。因为CS-氧化魔芋水凝胶的制备过程是简单的、可行的，并且通常在温和的条件下进行，而且不使用任何外来的有毒的交联剂，如乙二醛、戊二醛、和二环氧化合物等，我们相信这样一个复合材料会在创面处理、药物输送、组织应用工程等相关领域有着很好的潜在应用。

实验部分

材料

魔芋葡甘聚糖是购买于花仙子魔芋公司（中国，湖北，十堰）。葡甘聚糖含量在95%以上，重量平均分子量为（）为9.80times;105（根据制造商的说明书）。90%脱乙酰度CS 购买玉环海洋生化有限公司（中国，浙江），数量平均分子量(）为3.11times;105（由粘度测量确定）。抗感染药物氧氟沙星（Floxin）是来自于昆山双鹤医药有限公司（中国，江苏）。透析管（截留分子量，10000 - 8000）以及其他化学分析级药品，如丙酮、乙酸、乙二醇、高碘酸钠、盐酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾磷酸盐、氯化钾、氯化钙等来自于中国国药集团化学试剂有限公司，2.2和7.4的缓冲溶液就是由上述药剂配制得到的。

氧化魔芋葡甘聚糖的合成

魔芋葡甘聚糖是用高碘酸钠氧化的。在300毫升的2%（W/V）KGM水分散液（0.037mol）中加入0.79克（0.0037mol）高碘酸钠——理论上生成氧化程度为10%的多糖，然后在黑暗中，于30℃条件下搅拌12个时。然后加入乙二醇（5毫升）到反应混合物中，以除去未反应的高碘酸钠，再搅拌2 h。反应结束之后，反应产物在蒸馏水中透析三天，蒸馏水要更换几次，到最后碘酸盐完全除去（用硝酸银检查）。反应产物[二醛魔芋葡甘聚糖（DAK）]在3000转条件下分散离心10分钟,然后DAK以沉淀的形式从上清液中分离开来，再用丙酮洗涤三次，干燥的样品存放于P2O5真空干燥器以备后来使用。氧化程度是根据Bouhadir等人的方法确定的。产品的最终产量也被计算了出来。分子量的测定是通过排阻色谱和静态激光光散射 (SEC-LLS)的方法在激光光度计（黎明DSP，怀雅特技术公司）上、于632.8纳米条件下来进行测量的，同时确定了DAK的重量平均分子量（）和多分散性指数（=）这个样品是用0.9%重量/体积的氯化钠水溶液来洗脱的，流动相的流速为0.5毫升每分钟。

水凝胶的合成及载药

双醛葡甘聚糖溶解的最终浓度为3%（重量/体积）。CS是溶解在0.5%（体积/体积）乙酸水溶液中，最终获得透明的、相同浓度的溶液。随后，两溶液在高速搅拌下混合均匀。三种水凝胶的重量比DAK/CS为70:30，50:50，30:70。每个样品的体积大约为20ml,水凝胶是在酸性条件下（pHfrac14;3）生成的，这样不仅仅保证了CS链上有游离胺的存在从而能发生希夫碱反应，同时也阻止了希夫碱的快速水解。然后把样品放置在冰箱中12h，使之熟化，冰箱温度为4℃。上述不同比例水凝胶样品编码为7DAC，5DAC，3DAC。水凝胶是在常温下干燥的，直至重量恒定不变，然后储存后以备后来使用。样品药物氧氟沙星是先溶解于3%（重量/体积）的壳聚糖醋酸水溶液。将上述CS溶液与3% DAK水溶液（W/V）混合后，然后常温干燥，从而制备出载有氧氟沙星的水凝胶。干凝胶上的载药量为2%（重量/重量）。

水凝胶的表征

傅氏转换红外线光谱分析仪(FTIR)的光谱数据是通过分光计 (Nicolet 170SX, USA)记录的。各个样品被研磨碎后混合KBr并制成丸状，在4000到550cm-1进行扫描，并以KBr药丸作为空白背景。光谱信号的值为多于16次扫描的平均值，扫描时的温度为室温，分辨率为4cm-1。各个样品的广角X射线衍射图的测量设备是Shimadzu XRD-6000（日本）衍射器，配备有CuKa发射器，电压40kv,电流40mA,扫描频率为4omin-1,衍射角的范围是从2theta;=5到37o。CS-DAK水凝胶的表面形态和内部结构是通过SEM扫描冷冻干燥的样品（冷冻温度为-55℃，从而确保孔状结构不受破坏）来研究的。在标本上涂有一层薄薄的金膜，然后在显微镜（S-570，日立，日本）下用常规方法检查。孔和壁厚的平均距离（即，相邻孔间的平均距离）也是用几何法测量屏幕。

二维凝胶膜的制备及机械性能研究

将壳聚糖（1.5%重量/体积）溶解在0.5%（体积/体积）乙酸水溶液中，DAK（1.5% 重量/体积）溶解于去离子水中。然后将这些溶液按照适当的比例在高速搅拌下混合均匀从而的到不同的混合比（重量比DAK/CS分别为 70:30, 50:50, 30:70）。将DAK与CS的均相混合物脱气后分散在玻璃面上，3天内，水分在室温下蒸发出去。对于CS-DAK的水凝胶膜的拉伸强度和断裂伸度是由多功能电子拉伸试验机（CMT-6503 SANS试验机有限公司，深圳，中国),它的拉伸率为3mm·min-1。膜的尺寸为70mm长，10mm宽，初始夹具分离设定为4cm。在拉伸试验之前，先将薄膜样品放置在25℃，50%相对湿度[根据ASTM标准方法D882–91（ASTM,1995)]的坏境中适应三天。进行三次平行测量，从而获得薄膜的平均值。平衡溶胀性的研究

将一定重量的CS-DAK干凝胶膜分别浸入pH值为2.2，7.4缓冲溶液，并在25℃4保持48小时，最后达到肿胀平衡。将溶胀后的水凝胶取出来，并用滤纸吸去表面多余的自由水，然后立即用微量天平称量重量。平衡溶胀比（SR）用下列公式计算：

SR=(Ws-Wd)/Wdtimes;100% (1)

其中Ws和Wd分别为凝胶膜在溶胀状态和干燥状态时的重量。实验中每个凝胶样品重复三次，然后取平均值。

体外释放实验

水凝胶的体外药品释放实验是在振动筛中进行的，振动速度为50rpm，温度为37℃。将载有一定药量的水凝胶（0.2g）浸渍在100ml的释放介质中。pH为7.4和2.2的缓冲溶液为溶出介质，每隔一定时间，抽出5毫升溶液并补充等量的溶出介质从而使溶液的体积不变。从水凝胶中释放出的氧氟沙星的量是通过紫外-可见分光光度计(Shimadzu UV-160A, 日本)在288nm处测量并根据以前的校准标准计算出来的。

结果与讨论

氧化魔芋葡甘聚糖的合成及表征

魔芋葡甘聚糖是beta;-（1,4）键位上连有D-甘露糖和D-葡萄糖的线性不规则共聚物。KGM上相邻的羟基可以被高碘酸盐特异性氧化断裂，从而形成二醛衍生物[如图方案1（a）所示]。根据相关文献，线性多糖主链上的糖苷键容易发生非特异性氧化断裂，从而导致分子量的显著减小。在这篇论文中，KGM的氧化是可以保护KGM打大部分性能不受破坏，并且能保持相对大的分子量，相对于纯KGM（9.5times;105）而言（KGM的片段生成DAK的过程图1所示）。

显然，DAK的低的产率可能是由于非特异性氧化产生的小链片段能够很容易的通过透析膜。我们还发现，DAK可以溶于水溶液中，但溶解速率较比纯KGM低，这可能由于DAK分子上的羟基与醛基生成的可逆半缩醛键的存在，这个临时交联网络会阻碍溶解速率。

方案一：（a）高碘酸钠氧化魔芋葡甘聚糖，（b）壳聚糖通过希夫碱反应交联氧化魔芋葡甘聚糖

图一：DAK片段在25摄氏度、0.9% w/v氯化钠水溶液的尺寸排阻色谱

图二：CS-DAK复合水凝胶的照片

KGM被高碘酸钠氧化的反应可以通过红外光谱检测出来，图3显示了纯KGM和DAK的红外光谱。从纯KGM的红外谱图（见曲线a）中可以看出，乙酰基中的羰基的吸收带在1734cm-1处，在1645cm-1处那个十分明显的峰是由于平面内的水分子变形。然而，与魔芋葡甘聚糖的谱图相比较，氧化作用导致DAK上出现了两个特征谱带（见曲线b），大约在1733和855cm-1处。前者也是由于醛对称振动带（羰基），这是从KGM上的一个小峰变化成DAK上一个明显的峰。后者可用归因于醛基与相邻羟基之间的半缩醛结构。

图三：红外光谱图（a）KGM,（b）DAK，（c）CS-DAK复合水凝胶，（d）CS膜（水乙酸法）

水凝胶的表征

三种不同重量比的CS-DAK的水凝胶是通过CS的氨基与DAK的醛基之间的希夫碱交联反应（方案一（b））制备出的，CS-DAK水凝胶的照片示于图2所示。

FTIR是用来研究聚合物分子结构的一个非常有用的工具，图三中就呈现出了相关样品的红外光谱图。这些光谱显示出了在3000-4000cm-1之间的峰宽，这些峰分别对应不同的O-H伸缩振动模式。这表明了分子间的氢键键合方式。在CS中N-H伸缩也有在同一区域重合，至于这些光谱图中的2920cm-1处左右的峰，这对应的是脂肪族-CH伸缩振动。正如我们所知，CS谱图上1657cm-1和1602cm-1处的特征峰分别是由于N-乙酰葡糖胺上的C-O的伸缩振动和NH2的弯曲振动（没有显示出来）。然而，CS膜的谱图（见曲线d）是不同于CS薄片的，602cm-1代表氨基官能团的峰消失了。在

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