羧甲基壳聚糖接枝丝肽的制备、表征和抗氧化活性外文翻译资料

 2021-12-27 22:02:57

英语原文共 7 页

羧甲基壳聚糖接枝丝肽的制备、表征和抗氧化活性

摘要

自由基与衰老、癌症和炎症的发生发展密切相关，清除自由基的能力是抗氧化活性的一个重要指标。在这项研究中，我们制备了一种可用于再生治疗的水溶性自由基清除和生物相容性共聚物。利用微生物谷氨酰胺转胺酶对羧甲基壳聚糖(CMC)进行丝肽(SP)改性，采用MTGase、FT-IR、NMR等方法对SP与CMC的成功接枝进行了研究。用紫外分光光度法测定取代度。体外抗氧化活性实验表明，在研究范围内，DPPH的清除活性最高为24.86%，91%的羟基自由基和36.8%的H2O2。最后，未发现该共聚物对NIH-3T3小鼠成纤维细胞的相关细胞毒性。简要介绍了CMC-SP as的应用前景一种用于再生治疗的抗氧化剂。

1.介绍

自由基是独立存在的具有一个或多个未配对电子的化学物质。为了保持自身的稳定性，它们可能会攻击细胞来捕获电子，从而导致细胞功能受损，并引发一系列[1]损伤。科学实验表明自由基的过量产生是其根本原因许多疾病，它破坏了细胞的氧化剂/抗氧化剂平衡，同时导致衰老、炎症、组织再生缓慢和伤口愈合[2-5]。为了避免这些损害，为了寻找新的材料，进行了深入的研究，抗氧化活性用于修复工艺[6]。对这个问题,许多具有抗氧化性能的天然大分子及其衍生物被用于清除自由基，包括多糖、生物活性肽等[7,8]。

壳聚糖(CS)是甲壳素的重要产物，也是甲壳素的重要组成部分以甲壳素为原料，在碱性介质[9]中脱乙酰得到甲壳素。CS作为一种天然高分子材料，具有许多优异的性能，包括成膜能力、抗菌活性和与不同物质的相互作用，使其广泛应用于许多领域，如医药、制药、食品和化妆品(9、10)。CS的各种化学修饰(如接枝、羧基化、酰化和季铵盐化)都是可能的聚合物链上的活性羟基和胺基[11,12]。其中最重要的衍生物之一是羧甲基壳聚糖(CMC)。改性CMC不仅保留了CS原有的抗肿瘤、自由基清除活性、抗菌性能，由于羧甲基的引入，还表现出水溶性的改善和生物活性的增强(13、14)。羧甲基纤维素的抗氧化活性与其直接相关在聚合物链[15]上的氨基和羟基，它们能很容易地从自由基中提取氢原子，形成稳定的大分子自由基[16]。以进一步提高具有抗菌、抗氧化、生物相容性等生物特性近年来，人们对CMC的性质、CMC的各种改性进行了研究[17,18]。然而，到目前为止，丝绸的使用多肽(SP)改性CMC尚未见报道。

蚕丝肽(SP)是蚕丝蛋白的水解产物，是蚕茧的重要成分[19,20]。SP的组成是相似的对角蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白[21]等蛋白有抑制作用。SP有具有良好的吸收机理，并具有一些无与伦比的生理功能，如降血糖、降胆固醇、抗氧化活性，改善肠道生理功能，并防止老化[20]。目前，肽的抗氧化作用机理尚未形成理论。但初步研究有研究表明，抗氧化活性与氨基酸的数量、种类、顺序和疏水性。此外，研究表明，其抗氧化性能也较好

由于这些优良的特性，SP在功能领域具有很高的开发价值食品、化妆品和药品。与肽中可与自由基反应的特定基团有关:氢化供体[22]。

酶法是一种改进或发展的方法多糖的新功能替代品。其中，微生物谷氨酰胺转胺酶(MTGase)是一种有前途、高效的选择。MTGase可以催化酰基转移反应。MTGase的生物学反应具有较高的选择性、特异性和无变化性，在其自身结构[23]中，已有报道催化大分子接枝和交联蛋白[24,25]。因此,工作的目的是利用MTGase制备CMC接枝SP作为生物催化剂。

本文报道了该化合物的制备、物理特性、抗氧化性能及生物相容性评价新型酶法接枝的mc - sp共聚物具有良好的抗氧化性能愈合。

2.实验

2.1材料

丝肽(Mw 700)和微生物谷氨酰胺转胺酶购自中国武汉华顺生物科技有限公司。壳聚糖粉末(Mw 520000，92%脱乙酰)

由金铃公司(印度科钦)提供。异丙醇,一氯乙酸，亚硝酸钠，亚硫酸氢钠，钠氢氧化物及其剂和试剂均为分析试剂级，未经进一步净化使用。是从国药控股化学试剂有限公司购买的。

2.2净化MTGase

首先，制备0.2 mol/L NaH2PO4缓冲液(PBS，pH = 6.0)，溶解一定量的MTGase粗粉PBS缓冲液中，离心于3000 r/min，持续10 min，上清液真空过滤经过两次过滤，滤液透析3天，然后冷冻干燥以获得MTGase冻干粉末和储存在4◦C。

2.3 CMC的合成

以羧甲基壳聚糖为原料，合成了羧甲基壳聚糖方法见文献[26]。简单地说，在之前制备的10毫升50%钠中加入10克壳聚糖粉氢氧根溶液，搅拌均匀，冷却后放入冰箱冷冻24小时。除去一定数量的碱化物壳聚糖放入三颈烧瓶中，加入200毫升异丙基以酒精为分散介质，在室温下搅拌将混合物加热至60◦C, 9 g一氯乙酸酸被分成两组并加入混合物中连续搅拌羧甲基化反应5小时所得CMC用无水乙醇冲洗，过滤得到三次。以羧甲基壳聚糖为原料，将其溶解蒸馏水，透析三天，然后浓缩旋转蒸发，最后在恒温下干燥得到羧甲基壳聚糖提纯。

2.4MTGase处理合成mc - sp共聚物

将1g CMC溶于磷酸缓冲液(PBS)中，pH值为6.0，同时加入一定量的SP和MTGase粉分别溶解于PBS (pH = 6.0)中，所有这些溶液在一个250毫升的三颈烧瓶中混合，一段时间后反应在40◦C，温度被提高到100◦15分钟然后冷却到室温。改性CMC产品经过过滤，透析3天，产品被冻干和得到了mc - sp共聚物。合成过程是如图1所示。

2.5取代度的测量

替换度(DS)定义为上的每个重复结构单元都被氨基取代CMC骨架。在本研究中，最大吸收波长用紫外分光光度法测定SP的含量测定SP的标准曲线，计算其含量对反应条件进行了温度优化，反应时间和SP与CMC的质量比。制备了一定浓度的SP溶液，并进行了紫外分光光度测定扫描波长范围为185 ~ 500 nm测定SP的最大吸收波长，如图所示图2中最大吸收波长为190 nm。的SP浓度在0.001 g/L至0.02 g/L之间呈线性关系用紫外分光光度法测定吸光度为190 nm。线性关系为式(1)，mc - sp的DS为由式(2)决定。

A = 48.6161C 0.03452R2 = 0.99446 (1)

DS = (2)

2.6描述

2.6.1傅立叶变换红外光谱分析

采用傅里叶变换红外光谱法(FT-IR)对a美国Nicolet 5700傅里叶变换红外光谱仪KBr阀瓣在4000-500 cmminus;1范围内。

2.6.2H NMR表征

在a上记录了CMC和CMC- sp的1H NMR谱环境温度下的布鲁克AMX-500核磁共振波谱仪。将样品溶解于1% DCl D2O和D2O中。

2.7体外抗氧化活性研究

2.7.1解决方案准备

为提供一套全面的抗氧化活性检测体系采用多种生化分析方法对CMC-SP进行了评价

DPPH;氢氧自由基;H2O2清除活性降低动力分析。首先研究了不同DS的共聚物蒸馏水浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg/mL，用于抗氧化剂的研究共聚物的性质。

2.7.2DPPH自由基清除活性测定

DPPH(1-1-二苯基2-苦基肼)自由基清除活动按照刘所报道的方法进行一些修改[27]。简单地说，2毫升的DPPH溶液(0.1毫米)将乙醇与2.0 mL样品(0.5-2.5 mg/mL)混合。2.0毫升

以混合在2.0 mL蒸馏水中的DPPH为对照。的取2.0 mL乙醇中2.0 mL样品作为空白。混合物大力摇晃，并在25◦C在黑暗中孵育30分钟。用紫外分光光度法在517 nm处测定吸光度。本实验测定了DPPH自由基清除活性样品确定如下公式:

Scavengingactivity (%) = 1 minus; Ds minus; Db Dc times; 100 (3)

其中Ds、Db、Dc为测试样品的吸光度空白组和对照组各1例。

2.7.3羟基自由基清除活性测定

测定了其清除羟基自由基的活性根据Li的方法对[28]进行了一些修改。含2.0 mL样品的混合物(0.5-2.5 mg/mL)， 2.0 mL含1.5 mM FeSO4, 2.0 mL含0.03% H2O2, 2.0 mL含1.5 mM

1,10-菲罗啉-乙醇溶液剧烈摇动在37◦C孵育1小时。使用水代替样品作为样品对照组，用水代替H2O2作为空白组。的用紫外分光光度法在536nm处测定吸光度。计算了羟基自由基的清除活性按下式:

清除活性y (%) = As minus; An Ab minus; An times; 100 (4)

其中，As, Ab, An为测试样品的吸光度空白组和对照组各1例。

2.7.4H2O2 清除活性测定

测定了H2O2的清除活性方法用刘对含[27]的混合液进行一定的改性样品1.0 mL (0.5-2.5 mg/mL)，磷酸盐缓冲液6.0 mL(0.1 M, pH = 7.4)和1.0 mL的40mm H2O2剧烈摇动在25◦C孵育10分钟。水代替样品以磷酸盐缓冲液代替H2O2作为对照空白。用紫外分光光度法在230 nm处测定吸光度分光光度法。计算了H2O2的清除活性按下式:

清除活性(%) = 1 minus; As minus; Ab Ac times; 100 (5)

其中As, Ab, Ac为测试样品的吸光度空白组和对照组各1例。

2.7.5还原力测定

还原力由文献描述决定李的报告[29]。一般情况下，含2.0 mL样品(0.5-2.5 mg/mL)， 2.5 mL六氰酸钾溶液(1%)大力摇晃，在50◦C孵育30分钟，加入1.5 mL(10%)三氯乙酸，搅拌均匀离心速度3500 r/min。上层2 mL混合蒸馏水2.0 mL, FeCl3溶液0.5 mL(0.1%)。最后,在700 nm处记录吸光度。吸光度越高表明了较强的还原能力。2.8用MTT法进行细胞毒性评估

2.8.1细胞悬液的制备

2.8.1细胞悬液的制备

采用DMEM培养基培养NIH-3T3细胞培养基(含10%胎牛血清和100U/m青霉素，100克/毫升链霉素)。后在潮湿的环境中茁壮成长空气中含有5%的二氧化碳在37◦C为2-3天，细胞被消化用0.25%的胰蛋白酶，用新鲜培养基代替悬浮液用于进一步的实验。

2.8.2MTT试验

采用MTT法研究了mc - sp的体外细胞毒性用NIH-3T3细胞进行检测，因为成纤维细胞发挥了an在伤口修复中发挥重要作用。每口井播种6000个细胞96孔板培养至80%融合。的培养液丢弃细胞，PBS冲洗3次，加入新鲜培养基。然后用不同浓度的PBS对样品进行溶解

加入浓度(10,50,100,500和1000ppm)每一个。加入相同体积PBS的细胞作为对照组。培养24小时后，用清水冲洗细胞PBS 3次，培养基更新。随后,20 L每孔加入MTT (5 mg/mL)，再孵育4 h，除去培养基，加入100 L DMSO进入每口井中溶解MTT福尔马赞紫色晶体。的

用微板在490 nm处测定溶液的吸光度读者。所有实验均为一式三份。相对细胞存活率(RCV)计算公式如下:

RCV(%) =

其中ODsampl为实验组的平均吸光度;ODcontral为对照组平均吸光度。

3.结果与讨论

3.1.SP接枝CMC的表征

3.1.1FT-IR光谱

壳聚糖(DD = 92%)、羧甲基纤维素(CMC)和羧甲基纤维素- sp的FT-IR光谱如图2所示。壳聚糖在3407 cm - 1和观察到1035-1150 cm - 1，对应于拉伸O H的振动，N H的延伸振动，和C O键，分别。1598 cm - 1处的条带被分配到nh初级胺的弯曲。此外，吸收峰在

1654 cm - 1和1322 cm - 1属于碳氧拉伸和碳氮残余n -乙酰基的拉伸(图3a)。这表明壳聚糖未完全脱乙酰化。不同于壳聚糖、羧甲基纤维素在1407 cm - 1处有很强的吸收峰这可以归结为COO -的对称振动。的重叠了COOC -基团的不对称拉伸振动随着NH2的形变振动，达到一个强峰值1597厘米minus;1(无花果。3 b) [17]。与CMC相比，最引人注目的是在1646和1545 cmminus;1处观察到与mc - sp的差异，他们被分配到典型的酰胺I和II条带。和在3432 cm - 1处峰值宽度的增加反映了来自SP的OH和NH2基团类似于之前的一些研究[31]。因此,结合的SP和CMC可以通过形成

酰胺键(图3c)。

3.1.2研究

用1H表征聚合物是一种有效的方法核磁共振光谱。接枝了CMC和CMC的1H NMR谱

SP溶于D2O如图4所示。CMC展示了一个小的单峰为4.35 ppm，这是由于质子(CH2 COOminus;)，与3.22-3.79 ppm的多个峰值有关(CH)和(CH2)在C3至C6时，2.40和1.89 ppmat的信号表明乙酰氨基存在(CH, C-2)和(CH3)[32]。与CMC相比，CMC- sp表现出了所有的特征,此外，它还显示出一个新的峰在5.16 ppm属于旋转构象由于阻碍

资料编号：[3394]

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