一种具有增强的酶活性的
新型脂肪酶－无机杂化纳米花
原文作者 C. Ke, Y. Fan, Y. Chen, L. Xu* and Y. Yan*
单位 Key Laboratory of Molecular Biophysics of the Ministry of Education, College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, China.
摘要：利用伯克霍尔德菌脂肪酶的有机成分和无机成分磷酸钙，合成了一种新型杂化纳米花。在最佳条件下，纳米生物催化剂展示了高达849.8 U的酶活，且是游离酶酶活的308%，它具有相对稳定的稳定性，突出了它用于工业化生产的潜在可能性。
关键词：脂肪酶－无机杂化纳米花； 增强酶活； 稳定性； 工业化
正文：
在过去的几十年里，许多固定化酶的技术被用于改善酶的性能[1; 2]。作为固定化程序中最重要的因素之一，固定化的支撑结构引起了相当大的关注。在支撑结构，材料的成分、大小、形状、机械强度、亲水性、官能团种类和一些其他性能的选择上，应该充分考虑到根据酶的类型和应用来进行选择[3]。固体载体提供了可分离和再使用的主要优势，提高了酶的稳定性以及性能的改变。到目前为止，许多用作固定化的固体载体都已经被报道了，比如，孔隙玻璃珠，薄膜，大孔树脂，石墨烯，纳米管和聚合物或硅基单片材料。纳米生物催化，这涉及到固定在纳米结构材料上的酶，由于其比表面积大并且在应用中有很大的潜力，正引起越来越多的关注。具有不同材料和形态的纳米粒子被广泛报道为用于不同应用的固定支持材料[4]。Kavosi等人报告说，金纳米粒子包裹在胺树枝状聚合物分子中可组成一种免疫传感器[5]，用于检测PSA浓度，在有癌症生物标记的临床筛选中很有前景。Ranjbakhsh等人[6]利用涂抹硅土材料改良过后而成的磁性纳米粒子来固定猪胰腺酶，并改善了酶的动力学参数和稳定性。来自于里氏木酶的纤维素酶被固定在了一种被激活的磁性纳米粒子上，结果这种固定化酶提高了麻类物质中酶的糖化作用的预想产量[7]。随着关注酶固定化的报告数量的增加，纳米材料和纳米生物催化将有着巨大的潜力应用于工业化生产。
脂肪酶（EC 3.1.1.3）已广泛应用于食品、生物柴油的生产，手性药物和许多其他生物合成行业[8; 9]。为了改善酶的催化性能这一问题，已经开展了许多研究，然而仍有一些限制阻止他们在工业上的应用，比如稳定性差，狭窄的pH值范围适应性和对恶劣环境的敏感性[10]。在反应混合物中分离出游离酶也是很困难的，但这可以通过固定的方式来克服。此外，固定化已被证明是提高游离酶催化性能的最有用的策略之一。在这项研究中，伯克霍尔德菌脂肪酶（BCL）被选为固定对象，是因为它的催化用途广泛，无论是生物燃料合成、生物精炼还是各种在水或非水相反应，都能起到催化作用。在我们之前的研究中，BCL已经被用于生物燃料合成以及由于它所表现出的非常高的催化活性而被用于固定化。李等人[11]研究了BCL的手性拆分特性和在多壁碳纳米管上固定的形式，都有非常高的活性，在生物制药领域中显现出了光明的前景。
2012年，葛等人[12]率先报道了利用BSA–Cu3(PO4)2·3H2O构成有机-无机杂化纳米花；随后，一些酶—无机杂交种被报道[13; 14]。然而，很少有关于脂肪酶和它的纳米混合物的报道[15; 16]，而这些酶活是相当的低。因此，在这项研究中，我们合成了一种新的杂化纳米花，由伯克霍尔德菌脂肪酶（BCL）和磷酸钙(Ca3(PO4)2)构成。它有一个有趣的类似花的纳米级结构。我们对它的属性进行了检查和讨论，结果显示这种纳米生物催化剂在拆分反应中展现出更高的酶活性和加强的操作稳定性。
纳米花合成的典型实验：在pH为6.7的条件下，5mL的磷酸盐缓冲（PBS）溶液（20mM）中加入100mu;L CaCl2（200mM），其中加入24 mg·mL-1BCL，随后将该混合物保持在室温下（大约25 ℃）24小时。在所有接下来的实验中，条件与上述的实验保持一致，除非规定之外。该混合物在4 ℃，12000转/分钟的条件下离心10分钟，后转移上清液。上清液中的蛋白质含量通过布拉德福德蛋白测定法[17]检测并计算其固定化效率。然后回收固定化酶（酶—无机杂化纳米花），将其放在恒温真空干燥器中晾干，供以后使用。利用扫描电子显微镜显示纳米花的形态，如图1所示，当酶蛋白增加的时候，片状堆积而成的纳米颗粒在形态上转变成了类似于花的形状，它的花瓣大约有2-3微米宽。
图1 不含脂肪酶的合成产物的SEM图像（a）和（b）
（条件：24mg·mL -1脂肪酶加样，20mM PBS）
随着PBS浓度（从5mM到30mM）的增加，杂交种的花瓣逐渐增大了。在一个较低的PBS浓度条件下，花瓣是不完整的，而且没有明显类似于花的纳米粒子。当PBS浓度为20mM时能形成一个独特和稳定的结构，超过20 mM，花瓣嵌入了多余的磷酸钙中且类似于花的结构是不存在的了(图2)。
图2 BCL-Ca3（PO4）2杂合体在不同PBS中的SEM图像
浓度（（a到f）从5mM到30mM）；脂肪酶加载量是24mg·mL -1
在固定的过程中，对脂肪酶负载量和PBS浓度对固定化的影响效率和作用能力进行了检查。最佳确定的固定条件如下：脂肪酶加入24mg·mL-1和20mM浓度的PBS（图3）。利用酶动力学拆分(R,S)-1-苯基乙醇的反应，对酶活性和对映体选择性（ee值）进行了评估。在文献中有很多关于1-苯基乙醇与醋酸乙烯酯的酯化反应的对映选择性的报告[18; 19]，它可以被看作是一个模型反应。在最佳的固定条件下，最高固定效率和ee值分别为51.2%和91.1%，酶活力为849.8U，是游离脂肪酶的308％。而且，在测量稳定性时以及杂化纳米花对映选择性分辨率的可重用性，据观察，它可以在15天储存期间仍能保持其原始活力的75％以上以及五次再使用后其酶活力可保持原来的80%，表明混合的生物催化剂拥有一个更高的稳定性。然而，经过测量，混合物的水解和酯化能力，被观察到在某种程度上下降了（数据未显示）。其中的详细理由需要进一步调查[20]。
图3 脂肪酶负载量（a）和PBS浓度（b）对固定效率和ee值的影响
固定化脂肪酶在脂肪酶负载量为24mg / mL和20mM PBS浓度时的储存稳定性（c）
和可重复使用性（d），表明混合纳米生物催化剂拥有批准的稳定性
其他条件是保持与典型实验相同
如图4所示，傅立叶红外光谱提供了直接证据用于脂肪酶——无机杂化纳米粒子的形成。一个P-O振动和拉伸的强烈特征峰（光谱a和c）在1037cm -1处被观察到。在530-670 cm-1处的相对较小的频带可能是桥接磷的弯曲振动，如O P-O，其有助于磷酸盐基团。这两个高峰证明了Ca3(PO4)2的存在。频谱b展现了游离BCL蛋白的特征峰。在1650-1680 cm -1，1350-1460 cm -1和1020-1220 cm -1处有三个宽带，这是肽键及其延伸蛋白质的特征，例如
-NH2和C O。在2800-3000 cm-1处的宽而强烈的峰被认为是-CH2和-CH3。酶固定化后，BCL的位于1650-1680 cm -1和2800-3000 cm -1处的特征峰被保留下来，而在1350-1460 cm -1和1020-1220 cm -1处的峰被削弱了。这表明在逐渐形成Ca3(PO4)2的过程中，蛋白质的二级结构发生了变化，这可能会导致催化性质的变化[21]。据报道，Barbe等人[22]发现，在BCL活性位点上有“盖子”结构。
图4 Ca3（PO4）2·nH2O（a）的FT-IR光谱。 BCL（b）；
和BCL-无机杂化物（c）
“盖”结构的不同程度的开放导致了不同的酶活性[23]。Ca3(PO4)2的形成过程是不可见的和复杂的，这可能在某种程度上打开了“盖子”，导致了“盖子”的增加。导致脂肪酶的酯交换活性增加。
能量色散光谱仪（EDS）分析被用于脂肪酶——磷酸钙纳米花（BCL-Ca3(-PO4)2·nH2O）的表征。如图5所示，碳（C），氮（N）和硫（S）的峰被归因于脂肪酶蛋白质，钠（Na）峰的存在归因于样品制备缓冲液。这个结果进一步证明了脂肪酶——磷酸钙杂化纳米花的成功制备。
图5 BCL-无机杂化纳米生物催化剂的EDS光谱
总之，这项研究报道了一种合成新的脂肪酶 - 无机杂化纳米花的新颖且简便的方法。那固定化脂肪酶似乎是一种具有高比表面积的类似多孔的纳米花结构。扫描电子显微镜（SEM）分析可以直接观察到杂交体的形态，并且在脂肪酶加入量为24mg·mL-1和PBS浓度为20mM的最佳固定条件下获得类似于花的蛋白质的结构。
固定化脂肪酶的拆分活性为849.8U，比游离脂肪酶高308％。这固定化脂肪酶表现出了高稳定性并且在储存15天后仍保持其原始活性的75％以上，而且能够在5次再利用后仍保持原始活性的80％左右。 此外，FT-IR光谱提供了脂肪酶蛋白质结构改变的证据，这可能导致BCL脂肪酶的变化。 考虑到具有广泛应用的类似于花的杂化纳米结构，这种新的脂肪酶－无机杂化纳米生物催化剂可能在许多工业应用中是很有前景的，如生物燃料，生物制药和生物传感器。
感谢
本研究得到了国家自然科学基金（No. 31170078和J1103514），国家高技术研究发展计划（No.2011AA02A204和2013AA065805），湖北省自然科学基金（No .2015CFA085）和华中科技大学基础研究基金（2014NY007,2014QN119和2012SHYJ004）的支持。作者感谢华中科技大学分析测试中心在SEM，EDS和FT-IR测量方面的宝贵帮助。
参考文献
[1] Rodrigues R C, Ortiz C, Berenguer-Murcia A, et al. Modifying enzyme activity and selectivity by immobilization[J]. Chemical Society Reviews, 2013, 42(15): 6290-6307.
[2] Garcia G C, Berenguer M A, Fernandez L R, et al. Potential of Different Enzyme Immobilization Strategies to Improve Enzyme Performance[J]. Advanced Synthesis amp; Catalysis, 2011, 353(16): 2885-2904.
[3] Duraacute;n N, Rosa M A, Drsquo;annibale A, et al. Applications of laccases and tyrosinases (phenoloxidases) immobilized on different suppo
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