脂肪酶催化一步区域选择性合成克林霉素棕榈酸酯外文翻译资料

脂肪酶催化一步区域选择性合成克林霉素棕榈酸酯

原文作者 Zhixian Li, Yifei Zhang, Mengmeng Lin, Pingkai Ouyang, Jun Ge, and Zheng Liu

单位：清华大学化工系

摘要：

化学合成克林霉素棕榈酸酯，一种比克林霉素有很大改善作用的前药，仅在克林霉素的2-羟基上才能实现单酰化，这需要经过艰苦的保护和去保护步骤，总收率在50%以下。本文报道了以固定化南极假丝酵母脂肪酶B(Novozym435)为催化剂，一步合成区域选择性高的克林霉素棕榈酸酯的第一个例子。以甲苯为溶剂，在12 h内合成反应转化率达到90%以上，而且在克林霉素的2-羟基处有高度的区域选择性酰化反应，在良好的区域选择性下实现的显著改善的转化率使该酶工艺对克林霉素脂衍生物的合成具有一定的吸引力。

引言：

酶催化技术具有化学、区域和对映选择性高的优点，是广泛的化工和制药工业中改善生产工艺技术，同时也是最绿色环保的技术之一。酶法的使用降低了能源消耗，避免了费力的化学合成步骤，产生的废物和有害物质也较少。酶催化的优点促使我们探索一步酶促合成克林霉素棕榈酸酯的可能性。这是一种已建立的克林霉素抗生素前药，对革兰氏阳性菌与革兰氏阴性厌氧菌都有较好的抑制作用。它广泛应用于呼吸道感染、皮肤感染、皮肤感染、软组织感染等疾病的治疗，可作为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的一线治疗方案。所有这些都吸引了越来越多的人对这种抗生素的临床实践感兴趣。然而，目前所采用的克林霉素棕榈酸酯的化学合成具有选择性的限制，必须通过保护和去保护程序才能在2-羟基位置实现克林霉素的单酰化(方案1)。这导致产量低于50%，产生各种废物和副产品，给接下来的加工带来沉重负担。脂肪酶催化了高区域选择性的酯化反应，因此在合成克林霉素棕榈酸酯方面具有广阔的应用前景。这里，我们描述了用酶催化克林霉素与棕榈酸乙烯酯的区域选择性酰化反应达到一步合成克林霉素棕榈酸酯 (方案1)。

结果与讨论：

图1 (A)有机溶剂中克林霉素棕榈酸酯的酶催化酰化反应及(B)克林霉素棕榈酸酯的化学合成工艺

本文研究首先从不同来源的工业化脂肪酶催化剂中筛选出合适的脂肪酶催化剂，考察了其在甲苯中对克林霉素与棕榈酸乙烯脂酰化的活性。为了避免化学平衡对最终转化率的影响，选用了乙烯基棕榈酸酯作为底物，加入过量的棕榈酸乙烯酯，加快反应速度，提高克林霉素转化率。

表1.不同类型脂肪酶合成克林霉素棕榈酸酯

实验条件为：0.1mmol克林霉素无碱，0.3mmol棕榈酸乙烯酯，30 mg/mL Novozym435，2 mL溶剂，200 rpm，40°C，9h。

研究结果在表1中列出，其中表明固定化假丝酵母南极脂肪酶(Novozym435)在经过9h反应后，产率最高(88%)。结果表明，产率较中等的是TL IM 脂肪酶，产率较差的为RM IM 脂肪酶与皱褶假丝酵母脂肪酶，而TL 100 L脂肪酶和猪胰脂肪酶未显示出所需的活性。因此，选择Novozym435合成克林霉素棕榈酸酯。

表2.Novozym435在不同溶剂中催化合成克林霉素棕榈酸酯

完整的实验细节和有关酶的详细信息可在SI中获得。采用高效液相色谱法测定转化率。实验条件为：0.1mmol克林霉素碱，0.3mmol棕榈酸乙烯酯，30 mg/mL酶催化剂，甲苯2mL，200 rpm，40°C，9h。

研究了不同对数p(-1.0~3.9)的溶剂对Novozym435催化反应的影响。表2表明，在较疏水的溶剂(甲苯和正己烷)中，转化率较高(88%和90%)，而在亲水性很强的溶剂(DMF和二恶烷)中，转化率较低(0%和5%)；这可能是由于这些亲水溶剂从酶分子中剥离出必需的水，导致酶变性。在THF和二氯甲烷中的转化率低于乙腈和丙酮，这可能是由于四氢呋喃和二氯甲烷极性过高，导致蛋白质结构的扭曲和酶的失活所致。考虑到底物的转化率和溶解度，选择甲苯作为溶剂进行后续研究。

图1 (A)反应温度对转化率的影响。实验条件为：0.1mmol克林霉素无碱，0.3mmol棕榈酸乙烯酯，30 mg/mL Novozym435，2 mL甲苯，9h。(B)反应时间对转化率的影响。实验条件为：0.1mmol克林霉素碱，0.3mmol棕榈酸乙烯酯，30 mg/mL Novozym435，2 mL甲苯，40°C。

考察了温度和反应时间对克林霉素棕榈酸酯合成的影响，如图1所示，当温度高于40℃时，转化率大大提高(大于80%)。之前对Novozym435的热稳定性进行了研究，显示活动和转换可以在很大程度上保留，即使在高温 (约70℃)下。在转换率和节能性的基础上，选择了40℃为最佳温度。在较大规模的实验中，在200 rpm，40^OC，12h的条件下，在50 ml甲苯中加入1.06 g(2.5mmol)克林霉素碱，2.11g(7.5mmol)棕榈酸乙烯酯和30 mg/ml Novozym435；产品的纯化（见实验部分）与产量的sim;90%（1.57g）和纯度为97%（根据HPLC数据计算，见支持信息[Si]、图S3；3%的杂质是未反应的克林霉素和棕榈酸酯) 。与盐酸克林霉素棕榈酸酯(USP参比标准，美国马里兰州罗克维尔)相比，HPLC、NMR和红外光谱分析表明，新的酶促工艺没有引入新的杂质(见SI，图S14-S16)。

表3.克林霉素棕榈酸酯的红外光谱

产品的红外光谱显示出特征，3450(OH拉伸)，2850minus;2920(脂肪族)吸收带，1683(酰胺CO拉伸)cm^minus;1，可分辨在克林霉素中(表3)。该产物有一个额外的IR信号，该信号可归属于棕榈酰基，表明已生成克林霉素棕榈酸酯。此外，ESI-MS[m/z 663.9(M)]的结果显示克林霉素的单酰化作用(详见)。

为了考察Novozym435催化的酰化反应对克林霉素结构中三个羟基的区域选择性，分别用¹³C、¹H核磁共振和差示法对初始反应物克林霉素和产物克林霉素棕榈酸酯进行了表征(详见SI)。此外，产品结构由HMQC NMR谱中关键的碳原子和氢原子的信号进行鉴定，进一步证实（图2）。

确定了羟基的酰化使邻酰化碳原子的峰发生了下场位移，并使对应于邻碳原子的峰发生了上场位移。产物的¹³ C 的NMR谱在delta;173.2(C=O)和21.0~35.0(脂肪族CH链)处有额外的碳信号(表4)，表明了预期酰化的发生。克林霉素的C-2(delta;69.5)向下移动了1.5 ppm，与其相邻碳原子C-1(delta;88.4)和C-3(delta;71.0)对应的共振分别为4.0和3.1 ppm。转化产物的其它碳在起始底物的位置上发出信号，表明酰化只发生在2-0位置。在酰化产物的¹H的NMR谱中，delta;5.01处的H-2信号与克林霉素相比，向下移动了1.09 ppm(表5)。此外，H-1和H-3产生的共振在没有任何分裂模式变化的情况下略有向下移动，而H-4和H-5的特征信号几乎保持不变。邻质子的化学位移偏差也为新引入的2-酰基提供了证据。这些结果证实了Novozym435催化克林霉素酰化反应以区域选择性的方式产生2-邻酰基衍生物。

在克林霉素棕榈酸酯的三步化学生产中，每步产率分别为85%、83%和70%，总收率较低。化学合成路线的空时产率约为1.9 g/(L·h)，与本研究中的2.1 g/(L·h)酶合成路线相似。此外，为了测试脂肪酶催化合成的稳定性，对催化剂Novozy435进行了7次重复使用，无任何效率损失，重复使用生物催化剂后，每克Novozym435的产率可达10.1 g/g。

结论

总之，提出了一种Novozym435催化的克林霉素棕榈酸酯的一步和区域选择性合成方法，通过排除基团保护/去保护步骤，简化了合成过程。一步酶促合成在2-0位的选择性可达100%，比所建立的三步化学合成法的产率高(90%比50%)。这些结果表明了脂肪酶催化一步合成克林霉素棕榈酸酯的可能性。

实验部分：

所有的酶过程都是在温度控制的孵化器中进行的，200转/分摇动. 用50 ml甲苯溶解克林霉素1.06 g(2.5mmol)和棕榈酸乙烯酯2.11 g(7.5mmol)。室温搅拌30 min后，加入1200 mgNovozym435，在一定温度下孵育。反应后，对混合物进行过滤，然后蒸发溶剂。然后加入二氯甲烷，再加入盐酸调节pH值至1-2，然后蒸发溶剂。产物经少量乙醇溶解后，再在乙腈中沉淀。经过滤(1.57 g，90%)得到纯化产物，经NMR分析，未生成3-和4-棕榈基区域异构体。经高效液相色谱分析，得到97%的纯度(SI中的图S2，杂质主要为克林霉素和棕榈酸酯)。通过核磁共振分析对产物进行了表征。以DMSO-d₆为溶剂，TMS为内参，在600 MHz的JEOL仪器上记录了¹H，¹³C，DMT，HMQC核磁共振谱。

参考文献

[1] (a) Savile, C. K.; Janey, J. M.; Mundorff , E. C.; Moore, J. C.; Tam,S.; Jarvis, W. R.; Colbeck, J. C.; Krebber, A.; Fleitz, F. J.; Brands, J.; Devine, P. N.; Huisman, G. W.; Hughes, G. J. Science 2010, 329, 305.(b) Truppo, M. D.; Hughes, G. Org. Process

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