醛肟脱水酶的发现与研究进展
作者：Ke Chen, Zhongqiang Wang, Kan Ding d, Yongzheng Chen , Yasuhisa Asano
单位：贵州省生物催化与手性药物合成重点实验室，贵州省仿制药研究中心，遵义医科大学药学院，遵义
教育部基础药理学国家重点实验室，教育部民族医学联合国际研究实验室，遵义医科大学，遵义
富山县大学生物技术研究中心，日本富山县
中国科学院上海药物研究所糖化学与糖生物学实验室，上海
摘要：自从Asano和Kato于1998年首次报道一种来自芽孢杆菌OxB-1菌株的醛肟脱水酶催化醛肟降解为相应的腈以来，已经分离出六种醛肟脱水酶，并对其进行了表征。这些酶在有机合成中的潜在应用代表了制备药物和工业化学品的有前途的绿色方法。本文综述了这六种醛肟脱水酶的研究进展。
关键词：生物催化；醛肟脱水酶；腈生产；醛肟-腈途径
1.简介
氰化物在化学、制药和植物药剂学领域发挥着重要作用。目前有三种主要的腈生产方法。在工业上，本体腈是通过氨氧化反应制备的[1]。另一方面，卤代脂肪族化合物的取代或烯烃与氰化氢的加成反应代表了大多数有机化学家制备腈的最常用方法[2-4]。最近，Asano集团从微生物中鉴定出一类酶，名为醛肟脱水酶，并显示出通过脱水反应从醛肟中生成腈的能力。这代表了“第三种方法”，即酶法（方案1）[5-7]。与化学方法相比，生物途径有许多优点。例如，对于有机化学家来说，最常用的方法的一个主要缺点是氰化物的毒性。此外，在开发新的化学方法的过程中，仍然存在一些问题。例如，一系列Pd（en）X2盐被用作将醛肟转化为腈和酰胺的催化剂（方案2）[8]，然而，钯催化剂价格昂贵。还有一种基于光敏化的方法，即将有效的可见光介导的醛肟和伯酰胺转化为腈（方案3）[9]。然而，这种方法也存在多个问题，包括催化效率低。因此，用于生物催化的醛肟脱水酶的发现代表了以绿色方式制备腈的巨大潜力。
肟是由醛或酮化合物与羟胺反应生成的有机化合物，含有极性基团，可参与许多有机化学反应，如经典的贝克曼重排反应。醛肟可视为醛肟，通常是腈生物合成的中间产物。长期以来，醛肟被认为是合成生物活性物质的中间体，如植物中的吲哚乙酸、氰苷和硫代葡萄糖苷[10,11]。然而，直到Asano的研究小组首次描述醛肟降解酶之前，人们对醛肟降解酶知之甚少，他们的研究表明，醛肟和腈降解酶的分布很广。在188种微生物中发现了醛肟和腈降解酶[12]，具有PAOx脱水和PAN水解活性的细菌和真菌列表如表1所示。红球菌YH3-3菌株是在含有吡啶-3-醛肟作为唯一氮源的培养基中分离出来的，该菌株使用醛肟脱水酶、腈水合酶和酰胺酶，而芽孢杆菌菌株OxB-1通过醛肟脱水酶和硝化酶的作用将苯乙醛肟降解为苯乙酸[12]。到目前为止，已经分离出六种醛肟脱水酶。虽然这六种酶催化同一类型的反应，即醛肟转化为腈，每种酶的催化性能不同。本综述将解释催化差异。Oxd（醛肟脱水酶）的分子量约为40 kDa[13]，其最适pH范围为5.5至8.0[13]。一些Oxd在自然界中以同型二聚体的形式存在，而所有Oxd都含有血红素b作为修复基团。Oxd的温度在30°C到45°C之间是稳定的，大多数Oxd在30°C表现出最大的稳定性 [13]。（Z） -苯乙醛肟是所有六种已知Oxd中反应最快的底物。Oxd的底物范围已确定，适用于多种底物类型，大多数醛肟脱水酶对脂肪族、芳香族和芳香族醛肟表现出最高的活性（方案4）。Oxd对2-芳基丙基醛肟等手性醛肟表现出高活性[14–20]。关于六种醛肟脱水酶底物范围的概述[13]，除上述六种酶外，还有另外两种醛肟脱水酶已得到纯化和表征，包括来自植物病原真菌菌核菌[21]的吲哚-3-乙醛肟脱水酶和来自慢生根瘤菌[22]的吲哚-3-乙醛肟脱水酶。之前关于这两种酶的综述[23–25]。
2.醛肟脱水酶
2.1来自芽孢杆菌的醛肟脱水酶（OxdB）
OxdB是在醛肟脱水酶家族中发现的第一种酶。Asano研究小组发现，在细菌细胞中，OxdB催化Z-苯乙醛肟（Z-PAOx）转化为苯乙腈（PAN）[6]。然后，生成的腈通过腈水解酶转化为苯乙酸（PAA）[6]。这项研究还表明，醛肟脱水酶和腈降解酶共存，它们之间的关系引起了人们的极大兴趣，因为对不同来源的“醛肟-腈途径”的遗传信息的研究可能揭示了该途径在自然界中的多样性和进化[26]。OxdB产生菌Bacillus sp.OxB-1首先通过驯化培养从土壤样本中分离出来[6]。由于Z-PAOx被发现对微生物有毒，因此在筛选培养基中加入了肉提取物、多肽和酵母提取物等营养物质，以降低其毒性，并在驯化培养四个月后进行菌株分离。
Oxd-B仅显示与其他Oxd约30%的氨基酸序列同源性。此外，Oxd-B是一种40kDa的单体蛋白质，与大多数其他二聚体Oxd不同。由于这些差异，很难将Oxd-B归类为Oxd。黄素单核苷酸（FMN）激活Oxd-B[6]，并恢复Oxd-B的活性，该活性可能在透析含有Oxd-B的无细胞提取物时丢失。然而，FMN恢复酶活性不太可能是酶中血红素基团被FMN取代的结果，因为动力学和光谱研究表明，FMN和酶形成复合物的可能性很小[27]。虽然黄素在酶反应催化循环中的作用被认为是瞬时还原，但FMN要求的确切性质尚不清楚[27]。当大肠杆菌在半厌氧条件下培养时，OxdB的比活性比在有FMN存在的有氧条件下培养的大肠杆菌转化子中的OxdB提高5倍。与环己烷甲醛肟相比，OxdB更喜欢苯乙醛肟和正丁醛肟。尽管这些差异似乎是由于不同的血红素环境，详细的潜在机制仍有待阐明。此外，Oxd-B更喜欢苯乙醛肟的Z型而不是其E型异构体（方案5）[27]。最近，Asano研究小组已经解析了Oxd-B的晶体结构（结果尚未公布），这可能有助于进一步探索其催化机理。
2.2禾谷镰刀菌醛肟脱水酶（Oxd-FG）
为了比较各种来源的Oxds的生化特性，特别是真核生物，Asano团队搜索了基因组数据库（Genebank），发现引起小麦和大麦枯萎病的禾谷镰刀菌（telemorph Gibberela zeae，包含编码4号染色体165270–166361位置Oxds同源物的基因[登录号AACM01000259][28,29]。该基因被扩增并克隆到pET28载体（pET28-OxdFG-His）中，并在大肠杆菌BL21（DE3）株细胞中表达。使用TALON柱纯化得到的Oxs-FG进行生化表征。Oxd-FG与其他已知细菌Oxds（芽孢杆菌属、红球菌属等）具有约20%的氨基酸序列同源性，并具有与Oxd-B相似的酶学性质。纯化的Oxd-FG的最大吸收峰（Soret峰）为420 nm。纯化的酶预计含有铁，但其吸收光谱不同于来自不同来源的Oxds，表明纯化过程中可能会损失铁。Oxd-FG的Soret峰值为420nm[16-19]。Oxd-FG和其他Oxds的Soret峰的位置可能是由于Oxds结构的多样性。Oxd-FG在pH值为5.5时表现出最高的活性水平，接近Oxd-A的最佳pH值[28,29]。添加二硫苏糖醇、巯基乙醇、半胱氨酸和硫代甘油等硫醇后，Oxd-FG的活性增加了两倍[28,29]。然而，与其他Oxds相比，Oxd-FG显示出不同的底物特异性。当使用带有芳烷基的醛肟作为底物时，Oxd-FG对E-异构体表现出对映选择性。当使用（E）-醛肟时，观察到（S）-腈的ee为83%，而使用（Z）-富集底物时，（R）-腈的ee为8%（方案6）（表2）[13]。此外，当使用溴代2-芳基-2-甲基乙醛肟时，只有Oxd-FG催化的进行了反应，而其他oxds没有（方案6）（表2）[28,29]。表2提供了Oxd-FG与其他Oxds的对映选择性比较。
2.3红球菌醛肟脱水酶（OxdRE）
Asano小组还在光活性铁腈水合酶产生菌Rhodococcus sp.N-771的腈水合酶酰胺酶基因簇的50个侧翼区域中发现了一个醛肟脱水酶（Oxd）基因[17]。该酶与OxdRG、OxdA和OxdB的氨基酸序列同源性分别为96.3%、77.6%和30.4%[17]。其亚基结构、最适反应温度和pH稳定性与OxdA和OxdRG相似。因此，OxdRE代表了大多数Oxds的共同特征，不包括前面讨论的OxdB[28,29]。OxdRE酶在大肠杆菌中表达，在lac或T7启动子的控制下，在其N端附着六组氨酸标签，以促进下游酶的纯化。OxdRE在中性pH和30℃表达最好，类似于OxdB。还原剂如Na2S、Na2S2O4、2-巯基乙醇和（S）-半胱氨酸，以及外源添加的电子受体如黄素、SO32-、可增强OxdRE的活性，和维生素K3[17]。OxdRE与OxdB在底物特异性方面不同。虽然OxdRE更喜欢底物E/Z-2-PPOx、E/Z-曼德拉醛肟、E/Z-环己烷甲醛肟和E/Z-异丁醛肟，但这些化合物不存在于OxdB中[6]。OxdRE的底物特异性似乎与同一菌株产生的腈水合酶的底物特异性一致[17–19]。
2.4球形红球菌A-4的醛肟脱水酶（OxdRG）
从球形红球菌A-4中纯化并鉴定了与腈水合酶（NHase）和酰胺酶共存的烷基醛肟脱水酶（OxdRG）。OxdRG在中性pH和30℃。在催化过程中，金属离子可以作为活化剂或抑制剂，具体取决于它们的浓度，然而，潜在的机理尚未确定。OxdRG和OxdB都需要一种还原剂，如Na2S来刺激它们的催化反应[16]。在涉及纯化OxdRG的分析中添加还原试剂可增强酶活性。在厌氧条件下进行Z-PAOx脱水时，OxdRG活性并未增强，尽管OxdB活性提高了近5倍[16]。OxdRG和OxdB在亚单位结构、底物特异性、激活剂和抑制剂作用方面也存在差异。例如，OxdRG以二聚体的形式存在，而OxdB是单体。此外，OxdRG比OxdB具有更广泛的底物范围，并且对各种芳烷基和烷基醛肟具有活性，尽管在这些化合物转化为相应腈形式期间，OxdRG对前者的活性较低。纯化的野生型和重组OxdRG的血红素含量低于OxdB，目前尚不清楚这种血红素是否在纯化过程中丢失[12,16]。由于其广泛的底物特异性，使用在大肠杆菌细胞中过度表达产生的完全重组OxdRG将是从相应的醛肟中生产各种腈的良好生物催化剂。此外，OxdRG可作用于2-苯基丙酸氧肟或曼德拉醛肟，表明有可能从醛肟中生成光学活性腈[12,16]。
2.5假单胞菌K-9（OxdK）中的醛肟脱水酶
Asano研究小组还分析了降解戊二腈的假单胞菌K-9中负责醛肟代谢的基因簇[18]。该簇由编码“醛肟-腈途径”基因簇中出现的蛋白质的基因组成[30-32]。该途径中的关键酶OxdK与其他已知Oxds具有32.7%-90.3%的氨基酸序列同源性[18,19]。在T7启动子的控制下，OxdK基因在大肠杆菌细胞中过度表达，然后使用共螯合TALON亲和柱、Superdex 200凝胶过滤柱进行纯化，并通过SDS-PAGE进行分析。OxdK是一种脂肪族醛肟脱水酶（EC 4.99.1.6），通过醛肟腈途径（醛肟腈酰胺酸酰基辅酶A）负责醛肟的代谢[18,19]。OxdK在中性pH和30℃[18,19]。在1 mmol/L的羰基试剂（如NH2OH、KCN和羰基试剂苯肼）和金属离子（如Fe3thorn;、Agthorn;和Cr3thorn;）存在下，OxdK活性被抑制80%–90%[18,19]。即使在厌氧条件下测量，OxdK对Z-PAOx的比活性也比OxdB低几百倍[28,29]。在厌氧条件下测量新制备的六组氨酸标记的OxdRE和OxdRG，发现OxdRE和OxdRG的Z-PAOx脱水比活性比OxdK高几百倍。OxdK活性水平低的原因尚不清楚[18,19]。OxdK可以催化各种芳烷基和烷基醛肟醛肟转化为相应的腈[18,19]。对E/Z-PAOx和E/Z-n-戊醛肟的OxdK脱水活性的测量与OxdB类似，两种异构体以几乎相同的速率以时间依赖的方式消耗[18,19]。
2.6氯仿假单胞菌醛肟脱水酶（OxdA）
通过对参与氯仿假单胞菌B23腈代谢的编码腈脱水酶的多种基因的分析，在编码酰胺酶的基因上游发现了醛肟脱水酶的开放阅读框[15]。从这个开放阅读框中获得的氨基酸序列与芽孢杆菌的同源性为32%。[5]。在大肠杆菌中表达时，发现这种醛肟脱水酶催化醛肟脱水成腈[5]。OxdA显示出包含Soret峰的吸收光谱，表明它是一种含血红素的蛋白质。与细胞色素P450等其他含血红素的酶不同，它不需要使用H2O2或O2作为催化介质[31,32]。野生型OxdA和OxdA突变体的晶体结构研究、光谱和静电势分析表明，位于OxdA活性位点的219位丝氨酸（Ser219）可能对催化至关重要，因为它可能通过与底物的羟基形成氢键来稳定酶底物中间体[31–33]。与OxdB相比，OxdA需要还原剂Na2S2O4，但不需要FMN。OxdA的分子量为76.2 kDa，由两个相同的亚单位组成（表1），因此它在细胞中以同型二聚体的形式存在。动力学研究表明，OxdA处理脂肪族醛肟的效率高于芳香族醛肟[15]。鉴定和功能研究表明，OxdA中含有铁和钙，在纯化或膜透析过程中，这两种金属离子的数量保持不变，表明这两种金属与OxdA紧密结合[15]。这些铁可能来自血红素，而钙可能是一种辅助因子。需要进一步的研究来确定钙的作用[15]。
3.有机合成的进展
3.1新反应
自Betke等人2
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