地衣芽孢杆菌-谷氨酰转肽酶的保守asn450残基的定点诱变外文翻译资料

 2022-08-06 09:38:15

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地衣芽孢杆菌-谷氨酰转肽酶的保守asn450残基的定点诱变

  1. 介绍

谷氨酰转肽酶(GGT；EC2.3.2.2)催化-谷氨酰肽中连接键的水解和-谷氨酰基向氨基酸、肽或水的亚基转移[1]。 这种酶在生物体中广泛分布[1，2]，在细胞外还原型谷胱甘肽(GSH)的代谢中起主要作用，使前体氨基酸同化后重新利用合成细胞内GSH[3-5]。 研究进一步表明GGT参与了许多关键的细胞活动，如衰老、凋亡和医药解毒作用[6-8]。 在人类中，它与几种与氧化相关的生理疾病有关[9，10]，因此是肝脏疾病[11]、心脏血管病变的常用标志。 除了生理学功能，GGT可用于生物催化合成各种谷氨酰化合物，具有加快药物和生物技术应用进展的巨大潜力[17-19]。迄今为止，成熟GGT的酶促反应已被证明遵循经典的乒乓机制[18,20–22]。在催化循环的第一步中，供体底物的-谷氨酰部分与活性中心保守Thr的羟基反应，形成四面中间体[18,20,22]。随后，游离胺供体从中间介质中释放，产生共价谷氨酰胺酶中间体。催化循环最终通过将-谷氨酰基转移到受体底物，通过水解或转肽反应来完成。尽管转肽反应在细菌中的作用尚不清楚[18,23]，水解和转肽反应被认为与生物体的重要生理过程密切相关。 异二聚体真核细胞GGTs常定位于质膜，其活性位点定位于细胞周质[24]然而，细菌酶要么存在于胞浆中，要么存在于细胞周质中，而且可能是异二聚体[25–28]或异四聚体[23]。已经证明，来自真核生物和原核生物的前体蛋白经过翻译后的自动蛋白水解酶处理，产生由大（L）亚基和小（S）亚基组成的成熟酶[20,29,30]。实验证明，S亚单位的N末端Thr在GGT酶的自催化过程中起着关键作用。在大肠杆菌GGT（EcGGT）的情况下，Ala替代Thr391阻碍了酶的成熟过程，影响了前提蛋白的自我加工与表达[31]。在其他GGT酶中，包括地衣芽孢杆菌GGT（BlGGT）[32]和热反硝化土杆菌GGT（GtGGT）[25]。虽然短芽孢杆菌GGT（BpGGT）的N末端截短似乎不影响成熟过程[28]，但其他一些区域或残基可能是GGT酶成熟过程的原因。通过基因缺失和位点特异性突变技术，我们先前的研究表明，选择性地去除BlGGT的C末端残基肯定会削弱其自身形成异二聚体的过程[33]，酶中的其他残基也被证明对成熟过程至关重要[32,34,35]。

基于EcGGT突变体（T391A）的结构信息，提出了GGT酶的自加工反应机理[36]。在这一机制中，水分子通过Ser388的羰基氧和Gly484的NH酰胺形成的分子内氢键， 于适当位置充当活化剂[36]。溶剂分子的存在对Ntn水解酶家族的自处理反应具有重要意义[37]。然而，溶剂分子参与GGT的自催化过程并不是普遍接受的。事实上，在T391A EcGGT的X射线结构的不对称单元中存在两个多聚物 链，并且水分子位于仅在其中一个链中充当活化剂的正确位置[36]。此外，在成熟的EcGGT与其他细菌和人类的对应物之间发现了显著的结构差异[38]。最近的一项X射线衍射研究表明，BlGGT含有一个更开放的活性位点裂缝，而这个裂缝不被盖环所覆盖[39]。人类GGT[38]、BsGGT[40]和其他同源细胞[23、25、28]都有这种结构特征。此外，一些GGT酶，包括BsGGT、BpGGT和BlGGT，在L-亚单位的C-末端有一个额外的序列（BlGGT中的残基384-398）[35]。据报道，这个额外的序列对BlGGT酶的自催化处理非常重要[35]。最近才根据地衣芽孢杆菌酶前体模拟物的晶体结构和突变研究建立了GGT前体自催化处理的基本方面[41]。在这项研究中，我们用其他氨基酸取代了BlGGT中保守的天冬酰胺450，以了解这一残基的作用。Asn450突变对BlGGT的自催化过程和转肽酶活性都有影响，表明该残基在酶前体成熟和催化功能中的重要作用。

  1. 材料和方法
    1. 试剂和菌株

Luria Bertani（LB）培养基的两种基本成分，bacto胰蛋白胨和酵母抽提物，是从Difco实验室公司（美国密歇根州底特律）获得的。基因特异性序列由台湾台北美思生物科技有限公司合成，列于表1。

表1

重叠互补引物用于定点诱变。

蛋白质

核苷酸序列（5→3）.a

科顿改变

n450q

(f)-CCAGGC GGCG CCAGGA AGTGCAGCCG

AAC→CAG

(r)-CGGCT GCACTT CCTG GCGCCGCCTG

AAC→GCG

n450a

(f)-CCAGGC GGCG GGAAGTGCA GCCG

(r)-CGGCT GCACTT CCGCG GCGCCGCCTG

AAC→GAC

n450d

(f)-CCAGGCG GCGCCGACGAAGTGCAGCCG

(r)-CGGCT GCACTTCGTCGGC GCCGCCTG

AAC→AAA

n450k

(f)-CCAGGCG GCGAAAGAAGTGCAGCCG

(r)-CGGCT GCACTTCTTT GGCGCCGCCTG

a 修改后的密码子用下划线标出..

快速定点突变试剂盒来自于斯特拉塔根尼（加利福尼亚州拉霍拉市，美国）。镍氨三乙酸亲和树脂购自美国加利福尼亚州瓦伦西亚市桥根公司。从Sigma-Aldrich精细化学品（美国密苏里州圣路易斯）中获得了l-谷氨酰对硝基苯胺（l-谷氨酸-p-NA）、对硝基苯胺（p-NA）和甘氨酸-甘氨酸。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和蛋白质浓度测定试剂均来自美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的Bio-Rad实验室。所有其他化学品均为市售化学品，未经进一步纯化即可使用 。

大肠杆菌Nova Blue（Novagen Inc.，Madison，WI，USA）被用于维持质粒，而另一种大肠杆菌菌株（XL1 Blue；Stratagene，La Jolla，CA，USA）被用作构建位点特异性突变的宿主。在大肠杆菌M15（pRep4）中进行T5 RNA聚合酶介导的基因表达。所有大肠杆菌菌株均在28℃或37℃的LB培养基中有氧培养。根据需要，将抗生素氨苄西林和卡那霉素分别添加到最终浓度为100 g/mL和25 g/mL的培养基中。

2.2 多条序列对比及计算机建模

BlGGT的氨基酸序列通过Clustal程序与其他物种的对应序列对比[42]。GGT酶的瑞士Prot获取码如下：BlGGT（Q62WE3）、BpGGT（F8SVM6），BsGGT（P54422）、解淀粉芽孢杆菌GGT（BaGGT；E1UV41）、反硝化硫杆菌GGT（TdGGT；Q3SJ07）、EcGGT（P18956）、聚乳酸菌GGT（LaGGT；A0NWX8）、幽门螺杆菌GGT（HpGGT；O25743）、铜绿假单胞菌GGT（PaGGT；Q9I406）和GtGGT（A4ITG5）。以BlGGT（PDB编码：4OTT）和T399A BlGGT（PDB编码：4Y23）的X射线晶体结构为模板，在SWISS MODEL Server[43]上建立了突变酶的分子模型。使用Coot[44]和Phenix[45]对模型进行了迭代循环的手动拟合，进一步改进了模型。

2.3定点突变

先前构建的pQE-BlGGT[26]质粒被用作PCR的定点突变的模板。反应混合物（50L）由10ng模板DNA组成，0.2分M的for-ward和reverse引物，0.2分dNTP的mM，以及2.5条高保真PfuTurbo DNA聚合酶。在16次热循环程序（95℃持续30秒，58℃持续1分钟，68℃持续10分钟）运行后，用DpnI内切酶处理PCR产物，该酶消化半甲基化模板，留下正向突变的刻痕DNA。之后，将消化产物转化为大肠杆菌XL-1蓝色超温特异性细胞，并通过灭菌环从LB板上提取单个菌落，通过DNA测序验证突变。

2.4野生型和突变型酶的表达与纯化

含有pQE-BlGGT或突变质粒的coli M15（pRep4）细胞在37℃下生长在100 mL添加抗生素的LB肉汤中。在OD600达到0.8–1.0之前，以0.1 mM的最终浓度向肉汤中添加异丙基-d-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG），并在28℃下继续培养C再静置6h。然后以12000g离心20 min，用50ml Tris-HCl缓冲液（25 mM，pH 9.0）洗涤两次。野生型突变酶的纯化如前所述[32]。蛋白质纯度和自催化过程的程度通过SDS-PAGE使用Laemmli缓冲系统进行检查[46]。利用计算机化密度计，利用CP-ATCAS 2.0程序（http://www.lazarsoftware.com）对凝胶中蛋白质条带的强度进行量化，从而评估自催化处理的程度。以牛血清白蛋白为浓度标准，用Bio-Rad蛋白测定试剂测定蛋白质浓度。

2.5.活性测定和酶动力学

BlGGT及其变体的酶活性通过不连续比色法测定，如前所述[47]。简而言之，每种酶和反应组分（1.25 mmL--Glu-p-NA、30 mmGly-Gly、1 mmMGCl2和50 mmTris-HCl缓冲液；将pH9.0）分别在40℃下培育10分钟。通过在适当稀释液中加入20-L酶溶液和足够的蒸馏水使最终体积达到1 mL来启动反应。在40℃下培育10分钟后，通过添加100 L乙酸（3.5 N）来终止反应。用紫外-可见分光光度计监测410 nm处的吸光度变化，测定反应溶液中p-NA的含量。GGT活性的单位是指在分析条件下每分钟产生1摩尔p-NA的酶的数量。野生型和突变型酶的KM和kcat值通过测量1 mL反应混合物中p-NA的形成和50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）中不同浓度的l--Glu-p-NA（0.1-2.0 KM）和固定浓度（30 mM）的二肽受体Gly-Gly来估计。为了估算动力学常数，用双倒易变换得到的数据点绘制了Lineweaver-Burk图。所有动力学实验至少进行三次。

2.6圆二色性（cd）和荧光研究

用jasco-815分光光度计（jasco，日本）在室温恒定氮气流量下，用0.1cm石英比色杯记录CD光谱。每个光谱代表在200到250 nm波长之间记录的三次累积的平均值，分辨率为0.2 nm，带宽为0.5 nm，响应时间为4 s，灵敏度为100 mdeg，扫描速度为20 nm/min。所有光谱通过减去缓冲空白进行背景校正。摩尔残基椭圆度的计算公式为：[]=obs（以mdeg计）/（蛋白质摩尔浓度times;路径长度（以nm计）times;蛋白质中氨基酸残基数）[48]。以摩尔残基椭圆度（MRE）为单位，用deg-cm2-dmol-1表示CD强度。

用jasco FP-6500荧光光谱仪，在280nm激发波长下，用0.5ml石英比色杯记录了稳态发射光谱。在240nm/min的扫描速度下，从300～400nm测量了浓度约为14.5m的蛋白质样品的发射光谱。缓冲组分对荧光的贡献从所有光谱中减去。每一个光谱都是三份，结果几乎相同。

3. 结果和讨论

3.1. 多序列比对和Asn450的局部环境.

与到目前为止已确定的其他GGT结构一致，BlGGT采用了属于Ntn氢酶家族的蛋白质的保守折叠[37]。 在BlGGT的晶体结构[39]中，大亚基包含一个由14螺旋、6小3组成的球状结构域10 螺旋和11股，小亚基由3螺旋、两个小的3组成.10螺旋和11股。 此外，这两个亚基提供链到一个几乎平坦的片状，构成了异二聚体排列的核心。 与它们的结构一致性不同，GGT酶的初级结构显示出很大程度的变异性。 跨越BLGGT残基399-585的小亚基仅与枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、幽门螺杆菌

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