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Leloir糖基转移酶作为化学品生产的生物催化剂

Bernd Nidetzky^{*,dagger;,Dagger;},Alexander Gutmann^{dagger;,sect;},and Chao Zhong^dagger;

^dagger;Institute of Biotechnology and Biochemical Engineering,Graz University of Technology, NAWI Graz, Petersgasse 12, A-8010 Graz, Austria.

^Dagger;Austrian Centre of Industrial Biotechnology(acib), Petersgasse 14, A-8010 Graz, Austria

摘要：糖基化是一种化学转化，在所有糖科学和相关技术中都至关重要。在合成糖基化反应中，提供良好的反应性和选择性控制的催化剂广受欢迎。天然生物合成中负责糖基化的酶是糖核苷酸依赖性（Leloir）糖基转移酶。先前寡糖和糖化天然产物的研究向合成以及小批量试点生产都是依赖于Leloir糖基转移酶。然而，尽管Leloir糖基转移酶被认为具有合成作用，但尚未在工业生物催化中得到广泛应用。在这里，我们展示了将Leloir糖基转移酶发展为用于糖基化化学生产的强大生物催化系统的进展和局限性。获得可以促进与原位糖核苷酸供应偶联的所需糖基化的高活性和稳定的（全细胞）催化剂仍然是一个难题。优化糖基转移酶级联反应以提高加工效率是另一亟待解决的问题。一些天然产物（例如黄酮类化合物，萜类化合物）的糖基化涉及受体底物溶解度，这是生物催化工艺设计面临的特殊挑战。通过此类酶的综合生物催化过程开发实例说明了克服这些问题的策略。

关键词：Leloir糖基转移酶，糖核苷酸，寡糖，聚糖，天然产物，生物催化

1.糖基化：碳水化合物结构和功能多样性的关键

糖基化指糖残基通过糖苷键的共价偶联，是造成自然界碳水化合物结构多样性的主要原因¹。糖苷是糖基化反应的产物，是生物学、化学及相关技术中的重要分子。从生物学上讲，它们包括糖基化的天然产物、游离形式或与其他生物分子（如蛋白质和脂质）相连的寡糖和多糖^1-4。除了影响产物的化学性质（如水溶性）外，糖基化还使其具有生物学特异性并影响其作用机理^5-7。包括蛋白质生物药物在内的许多与医学相关的分子在其（生物）合成中都涉及糖基化作用^8-10。此外，糖基化的天然产物和寡糖也有作为食品和饲料配料的用途^5,11。人们对小分子糖苷作为化妆品的活性成分以及香料和香料配料也有所研究^12-14。表1列举了糖基化产品的一些例子，这些产品具有广阔的工业应用前景。因此，有效的糖基化方法的开发是该领域研究的重要方向。

化学方法^15-19、生物催化方法^2,3,20,21及混合催化方法^4,22,23已被用于糖基化实验中。对于特异性和反应性的精确操控是糖基化的难题。对于生产规模的糖苷合成，需要特别注意该过程的绿色化学特性²⁴。减少废物的产生（例如，通过避免保护基团化学反应）和使用催化剂是要考虑的重要原则。酶有望作为糖苷合成的催化剂。然而，在所需糖苷和可行的酶促转化反应之间存在着不小的差距。因此，开发新的用于糖基化的酶是很重要的。

2.Leloir糖基转移酶

Leloir糖基转移酶代表了糖苷合成的天然原理^3,4,25。这些酶利用活化的糖供体（通常是糖核苷酸）作为底物。从化学的角度来，糖基转移酶反应是糖基异头碳上的亲核取代，进行构型的反转或保留^1,2,25，如表2所示。

糖基转移酶是立体选择性酶。在与提供几个糖基化位点的受体反应中（参见图1），糖基转移酶通常表现出良好的位点选择性^{4,11,13,14,25,28}。因此，糖基转移酶被认为是潜在的改变糖基化的“游戏规则”的催化剂，可在单步转化中实现高精度糖苷合成^11,13,28，不需要纯化中间产物就可以进行迭代糖基化^28-32。然而，尽管具有这些优点，糖基转移酶尚未在工业化糖苷生产中担任主要角色。因为对于精细或特殊化学品的合成，通常认为糖基转移酶很难使用¹¹。

人们对于糖基转移酶的结构、功能、机理^{3,4,25,28,33-39}以及合成应用的原理和范围^{6,11,13,14,30,40,41}有很丰富的研究成果，然而，生物催化过程中的糖基转移酶却无人问津。这激发了当前的研究。

2.1.Leloir糖基转移酶的基本特性

糖基转移酶已经根据序列相似性进行了分类。目前，有105个糖基转移酶家族，其中约有40万种酶被归类于碳水化合物活性酶（CAZy）中^25,42。与其多样的功能相比，糖基转移酶仅具有一些基本的折叠结构，其中GT-A和GT-B折叠最常见（图1）。GT-A型糖基转移酶通常需要二价金属离子（Mg² ，Mn² ）才能发挥活性。糖基转移酶的这些特征已在其他地方进行了综述^25,37,43,44。

Leloir糖基转移酶在O、N、S和芳香族C受体位点催化糖基化^{25,33,37,38,45}。通常，它们对于不同的化学位点具有很好的区分度^33,37,38,46。在结构方面，如表3所示，转化的糖基转移酶通常在碱的催化协助下进行单个置换反应^25,33,36。转化的芳香族C-糖基化机理稍有不同（表3）。适当定位的邻羟基或对羟基的去质子化可用于在受体底物的活性碳中产生亲核特性^38,46-50。保留糖基的糖基转移反应似乎是一步进行的，没有形成共价中间体^25,36，但是，某些糖基转移酶可以利用共价催化³⁶。就底物选择性而言，Leloir糖基转移酶拥有广泛的供体和受体^11,13,33,40。一对供体和受体底物可广泛耐受两者的结构变异。一些糖基转移酶可促进单个受体分子上的多个糖基化^51,52或延长正在生长的聚糖链^31,32。这些酶已被证明可用于合成二糖基化的天然产物和糖胺聚糖寡糖化物^11,31,32。

2.2糖基转移酶反应的特征

在糖基转移酶反应中，两种底物都必须与酶结合形成三元复合物，然后才能进行转化^25,36。底物的结合和产物的释放可能涉及一定的次序，例如在人alpha;(1-4)半乳糖基转移酶中，受体结合需要糖核苷酸⁵³。但是，在其他各种情况下，底物结合是随机的⁵⁴。一种底物的结合通常会增强对另一种底物的亲和力。对于酶的实用性，通常较为看重以催化常数（Kcat）表示的其比活性。与糖苷水解酶/转糖苷酶^55,56和已确立生物催化应用的其他酶（例如酯酶/脂肪酶⁵⁷，乙醇脱氢酶⁵⁸）相比，糖基转移酶通常表现出较低的Kcat。尽管如此，有59个典型的Kcat值在1-20 s^-1或更小范围内^60-63。出于实际考虑，Km值应相对于合成中使用的底物浓度较低。但是，底物抑制通常与低Km有关⁶⁴。

反应中释放的核苷二磷酸可能导致产物抑制^61,65-69。受体与酶-核苷二磷酸复合物的结合可能会增强抑制作用。核苷二磷酸也通过质量作用影响转化。与人们长期以来的认识相反，糖基转移酶反应实际上是不可逆的⁷⁰。核苷二磷酸可使用磷酸酶原位水解^30,71，从而消除了抑制作用，并使反应平衡移向产物侧。解决抑制和反应平衡问题的另一种策略是从核苷二磷酸中原位回收糖核苷酸（见下文）。

具有10或更高的Keq值的反应平衡通常有利于糖苷的合成^1,25。取决于糖基受体基团（例如，糖羟基的〜12-14）与末端磷酸酯之间的pKa差异。核苷二磷酸（〜6-7），反应平衡取决于pH（表2）。Keq在相关pH范围内（例如6-12）随pH的增加而增加^1,26,72。因此，糖基转移酶反应涉及质子的净释放（核苷二磷酸的pHge;pKa），先前已被用于开发适用于高通量实验的酶分析方法^27,73,74。糖基转移酶反应可能需要控制pH值²⁶。糖基转移酶合成面临的稳定性问题多种多样。酶在反应条件下通常显示出仅几个小时的半衰期^61,75-77。因此，酶的总周转数（TTN）成为一个问题。因此，对于小分子糖苷而言，TTN为10⁶可使每克所用酶产生几公斤产品。糖基转移酶的TTN值尚未广泛获得，但与用于碳水化合物转化的工业用酶^80、81相比，似乎TTN值相对较低（10⁴-10⁵）^75,78,79，因此需要进行对糖基转移酶的稳定性的研究。

糖核苷酸可以在与酶促合成有关的时间内自发分解（24-48小时）^82-86。除了pH和温度，金属离子（例如Mg² ，Mn² ）也会影响其稳定性^82,83,86。例如尿苷5-二磷酸alpha;-D-葡萄糖（UDP-葡萄糖）通过释放尿苷分解5-一磷酸并伴随形成alpha;-D-葡萄糖1,2-环磷酸^83,86。因此，建立防止供体底物降解的条件成为反应优化的一项相关任务。

2.3.合成环境中的糖基转移酶反应

糖基转移酶的合成是生物催化与合成生物学和代谢工程紧密联系在一起的一个领域^2,6,30,87-91。用于酶促反应的供体和受体通常无法直接作为底物添加，他们从前体制备涉及多步（化学）酶促反应级联反应^30,89,92。这些级联在体外或通过与细胞代谢的整合实现为“自给自足”的生物合成途径。对于体外合成，可以使用分离的酶或整个细胞。活细胞“工厂”使糖苷可以从营养中合成，基于酶和细胞的糖基化代表了糖苷生产的互补策略。值得注意的是，他们的理论效率甚至接近极限，但实际操作中并不能达到。

在这里，我们主要关注与代谢无关的酶联级联反应。然而，所讨论的要点主要也适用于活细胞的糖基化。

在生物催化中应用糖基转移酶的主要（也是迄今为止最重要的）策略是合成糖苷作为最终产物。装配糖基残基作为生化保护基团（可根据需要除去）是糖基转移酶的另一种应用（表4）。实际上，糖基化天然用于排毒^93,94，并且是一种“自我抵抗”的机制⁷。

在体内生产过程中，beta;-D-葡萄糖苷的形成降低了香兰素对酵母细胞的毒性⁹⁵。吲哚酚是普通蓝染料靛蓝的一种高活性前体，被一种专用的beta;-葡萄糖基转移酶葡萄糖化，形成了相对低反应性和高可溶性的衍生物，称为尿蓝母⁹⁶。糖基转移酶的另一种可能的应用是通过对映选择性糖基化来拆分外消旋底物。来自拟南芥的UGT71B6酶对与（ ）-脱落酸反应形成相应的beta;-葡萄糖基酯具有很高的选择性，因此可以从（plusmn;）底物中分离出天然（ ）形式（表4）⁴⁰.读者可能会注意到，生物催化为手性拆分和引入保护基团提供了多种策略⁹⁷，糖基化只是众多可能性中的一种。

3.作为生物催化剂的糖基转移酶

众所周知，糖基转移酶难以制备为生物催化剂。由于生物催化剂制备的效率可以补偿糖基转移酶在比活性和稳定性方面的不足，因此需要引起研究者的注意。除了选择宿主和遗传系统外，对于许多糖基转移酶，可溶性表达蛋白的设计也很重要（例如，靶向截短以去除膜锚定部分；融合至增强溶解性的模块；去除或取代易于聚集的蛋白^98-100）。总体而言，微生物糖基转移酶比其高等生物的亲戚更容易通过重组产生。因此，它们被认为是最有前途的生物催化应用^28,30,37,101。相关的研究数据很难一概而论，因此我们使用有代表性的例子代替。支持信息中的表S1和S2汇总了大肠杆菌中产生的细菌唾液酸转移酶和岩藻糖基转移酶的表达数据。

蛋白质和活性产量的巨大变化取决于所使用的酶和表达策略。最佳表达的唾液酸转移酶的体积活度约为1times;10³单位/L。这明显小于用于糖基化的其他酶（例如，转糖苷酶，糖苷磷酸化酶）所达到的活性。举个例子，在大肠杆菌中重组生产蔗糖磷酸化酶（来自肠系膜明串珠菌）产生了约600times;10³单位/L的生物反应器产物⁸¹。这更凸显了糖基转移酶在生物催化应用中的重要杠杆作用，可以通过提高酶的生产效率来实现产量提高。除了提高体积活性外，还可以提高比活（基于细胞团块）。这将反过来使糖基转移酶作为全细胞生物催化剂的使用受益，使酶分离成为不再需要的工艺步骤。

除了微生物的糖基转移酶以外，来自高等生物的糖基转移酶对于合成也很重要。例如，使用哺乳动物糖基转移酶（例如，唾液酸转移酶¹⁰²）可以有效地实现蛋白质聚糖重塑。植物糖基转移酶对糖化“它们自己的”天然产物具有独特的特异性，包括广泛的黄酮类和萜类受体分子^{13,14,34,40,60}。除总是被用作基因表达宿

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