拟南芥WRKY38和WRKY62转录因子与组蛋白去乙酰化酶19在碱基防御中的相互作用w外文翻译资料

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植物细胞，第一卷。 20：2357-2371，2008年9月，www.plantcell.orga2008年美国植物生物学家协会

拟南芥WRKY38和WRKY62转录因子与组蛋白去乙酰化酶19在碱基防御中的相互作用w

金康昌，赖志兵，范宝芳，陈志祥1

普渡大学植物学和植物病理学系，西拉斐特，印第安纳州47907-2054

拟南芥WRKY38和WRKY62编码两种结构相似的III型WRKY转录因子，由水杨酸(SA)或丁香假单胞菌(Pseudomonas Syringae)以非表达依赖PR Gene(NPR1)的方式诱导。 抗病性和SA调控的致病相关1(PR1)基因表达在wrky38和wrky62单突变体中增强，在更大程度上在双突变体中增强。 过表达WRKY38或WRKY62可降低抗病性和PR1的表达。 因此，WRKY38和WRKY62作为植物基础防御的负调节因子。 WRKY38和WRKY62与组蛋白去乙酰化酶19(HDA19)相互作用)。 紫丁香也能诱导HDA19的表达，其诱导转录本的稳定性取决于SA和NPR1在感染植株中的稳定性。破坏HDA19导致抗性受损，而其过度表达导致对P的抗性增强。因此，HDA19与WRKY38和WRKY62在细菌病原体的基础抗性中具有相反的作用。 但无论是WRKY38还是WRKY62都是植物细胞的转录激活因子，它们的激活活性被过度表达的HDA19所取消。 WRKY38和WRKY62与HDA19的相互作用可能对植物基础防御反应进行微调。

导言

由植物检测入侵的病原体会触发一组复杂的信号转导途径和一组防御机制。在感知病原体/微生物相关分子模式(PAMPs)后，植物可以激活不同的丝裂原活化蛋白激酶级联，导致PAMP触发免疫(PTI)(Jones和Dangl，2006年)。成功的病原体通过分泌的效应蛋白抑制PTI，从而导致疾病。 植物宿主与毒力病原体共同进化，可产生特定的植物抗病性(R)蛋白，识别病原体效应，激活高效的效应触发免疫(ETI)(Jones和Dangl，2006年)。 PTI和ETI都与水杨酸(SA)、乙烯(ET)和茉莉酸(JA)等防御信号分子的积累有关)。 在拟南芥中，SA调控的防御反应，包括与病有关的(PR)基因的表达，需要PR基因1(NPR1)基因的非表达子的功能，该基因编码一种66-kD蛋白，具有锚蛋白重复序列(CaO等人，1997年)。 缺乏SA生物合成或信号的拟南芥突变体在其感染周期的整个或部分过程中对以活宿主组织为食的生物营养病原体的抗性受到损害。 另一方面，ET和JA介导的信号通路往往介导植物对坏死性病原体的防御，这些病原体在感染的早期促进宿主细胞死亡(Glazebrook，2004年)。 许多研究表明，SA和ET/JA信号通路是相互拮抗的(Kunkel和Brooks，2002).

1 通信地址zhixiang@purdue.edu。

根据作者说明(www.plantcell.org)中所述的政策，负责分发本文所述调查结果所必需的材料的作者是：陈志祥(zhixiang@purdue.edu)。

w在线版本包含纯Web数据。

www.plantcell.org/CGI/DOI/10.1105/tpc.107.055566

JA信号调节因子如COI1的突变可以增强病原体感染植物中SA的积累和信号传递(Kloek等人，2001年)，阻断SA的积累可以促进JA信号传递(Spoel等人，2003年)。 其他研究表明，SA和ET/JA信号通路在植物防御反应中可以积极地甚至协同地相互作用(Kloek等人，2001年；Mur等人，2006年)。 有人认为，SA和JA信号之间关系的明显差异可能是由于它们相互作用的浓度特异性结果所致(Mur等人，2006年)。 当这两种信号在低水平上应用时，观察到与JA或SA相关的基因的表达出现短暂的协同增强。 当在高水平或长时间应用时，这两个信号相互拮抗。

在调控与植物防御反应相关的基因中，WRKY DNA结合转录因子起着重要作用(Eulgem和Somssich，2007年)。 最近在拟南芥中的突变分析揭示了特定WRKY蛋白与复杂防御反应之间的直接联系。拟南芥WRKY70已被证明通过促进SA依赖和抑制JA依赖的反应来调节SA和JA介导的信号之间的串扰(Li等人，2004年、2006年)。 已证明WRKY70的突变可提高植物对生物营养和坏死性病原体的易感性，包括细菌病原体Erwinia Carotovora，以及真菌病原体Erysiphe cichoracearum和Botrytis cinerea(Li等人，2004年、2006年；Abu Qamar等人，2006年)。 此外，wrky70突变体在基础防御和R基因(RPP4)介导的对Oomycete Hyaloperonospora寄生虫的抗病性中都受到损害(Knoth等人，2007年)。相反，一些拟南芥WRKY蛋白，包括WRKY7、WRKY11和WRKY17，作为植物基础防御的负调节因子(Park等人，2005年；Journot-Catalino等人，2006年；Kim等人，2006年)。 这些基因的突变增强了基础植物对强毒假单胞菌的抗性。 结构相关的WRKY18、WRKY40和WRKY60具有部分冗余的负作用。

然而，wrky18 wrky40双突变体和wrky18 wrky40 wrky60三重突变体更容易受到坏死真菌病原体B的影响。 Cinerea（徐等人，2006年）。 因此，这三种WRKY蛋白似乎参与了防御机制对不同类型微生物病原体的拮抗串扰。 在先前报道的一项研究中，拟南芥丝裂原活化蛋白激酶4(MPK4)是JA/ET介导的防御激活剂和SA依赖性抗性抑制因子(Petersen等人，2000年)，被发现与MPK4底物MKS1相互作用，而MPK4底物MKS1又与拟南芥WRKY25和WRKY33相互作用(Andreasson等人，2005年)。 此外，WRKY25和WRKY33在体外被MPK4磷酸化，在短日生长条件下，WRKY33敲除突变体表达PR1水平升高(Andreasson等人，2005年)。 破坏WRKY33导致对坏死真菌病原体的易感性增强，JA/ET调控防御基因的表达受损（郑等人，2006年）。 这些结果表明，WRKY33作为JA/ET介导的途径的正调节因子，在抗坏死真菌病原体的抗病性中起着重要作用。 虽然wrky33突变体对丁香假单胞菌有正常反应。WRKY25突变增强了对细菌病原体的耐受性（郑等人，2007年）。 此外，WRKY25或WRKY33的过表达增强了对细菌病原体的易感性，抑制了SA调控的PR1基因的表达（郑等人，2006年、2007年）。 这些结果表明，WRKY25和WRKY33作为MPK4介导的SA抑制和JA/ET激活信号通路的下游成分。 因此，WRKY转录因子在植物防御反应中起着不同的作用。 WRKY蛋白的这些不同作用可能通过一系列相互作用的正负调节因子的作用，反映了植物防御的复杂信号和转录网络。

拟南芥WRKY38和WRKY62编码两个结构相关的III型WRKY转录因子，分别由病原体感染和SA处理诱导(Yu等人，2001年；Dong等人，2003年；Kalde等人，2003年；Mao等人，2007年)。 在本研究中，我们报告WRKY38和WRKY62作为植物基础防御的负调节因子。 WRKY38和WRKY62在细胞核内与组蛋白去乙酰化酶19(HDA19)相互作用，是植物基础抗病性的正调节因子。 无论是WRKY38还是WRKY62都能激活植物细胞中的转录，但这种活性可以通过过度表达HDA19而被取消。 因此，物理相互作用为防御抑制WRKY转录激活剂的功能拮抗提供了一种特定的机制，用于防御激活HDA19转录抑制因子，其可能在植物防御反应的严格调控和微调中起作用。

结果

WRKY38和WRKY62的结构、DNA结合和亚细胞定位

WRKY蛋白可分为三组(Eulgem等人，2000年)。 第一组包含两个Cys2His2 锌指基序，

第二组只包含一个Cys2His2 锌指基序。 第三组WRKY蛋白含有单个Cys2His2 锌指基序。 根据这一分类，WRKY38和WRKY62属于III组WRKY蛋白，每个蛋白都有一个Cys2His2 锌指基序(见补充图1A在线)。 除了保守的WRKY结构域外，这两种蛋白质在其N端具有相当程度的同源性，但其C端的序列相似性相对较低(见补充图1A在线)。

WRKY转录因子被认为通过在靶基因启动子区结合其同源的TTGACC/TW-box顺式元件并激活或抑制其表达而发挥作用(Ulker和Somssich，2004年)。 一些分离的WRKY蛋白已被证明与W-box序列结合(Rushton等人，1996年；Chen和Chen，2000年；Yu等人，2001年)。 为了检测WRKY38和WRKY62的DNA结合活性，我们在大肠杆菌中表达了基因，纯化了重组蛋白，并用电泳迁移率转移法测定了它们与含有TTGACC W盒序列(P12a；见补充图1B在线)的寡核苷酸的结合。 纯化的重组WRKY38或WRKY62蛋白与P12a探针孵育时，检测到迁移率降低的蛋白质/DNA复合物(见补充图1B在线)。将WRKY蛋白与突变探针(MP12a)结合，其中TTGACC序列改为TTGAAC是不可检测的(见补充图1B在线)。 因此，WRKY38和WRKY62与TTGACCW-box序列的结合具有很高的特异性。

为了确定WRKY38和WRKY62的亚细胞位置，我们构建了绿色荧光蛋白(GFP)融合到两种WRKY蛋白的C端。 融合结构由花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子驱动，直接轰击洋葱(Alliumcepa)表皮细胞。 瞬时表达的WRKY38-GFP和WRKY62-GFP融合蛋白仅定位于细胞核(见补充图1C在线)。 相反，在细胞核和细胞质中都发现了GFP(见补充图1C在线)。

依赖SA与NPR1的WRKY38和WRKY62的表达

为了分析WRKY38和WRKY62在植物基础防御中的参与，我们分析了它们在对毒力P.syringaePV番茄株DC3000(PstDC3000)的反应中的表达)。 如图1A所示，WRKY38和WRKY62转录本在健康的未感染植物中或在渗透50mMmgCl的植物中是不可检测的2 （模拟接种）。 在PSTDC3000浸润的植物中，WRKY38或WRKY62的转录本在接种后4h仍未检测到，但在8和12HAI时升高，通过24HAI然后下降到几乎基本水平(图1A)。 为了确定SA在病原体诱导的WRKY38和WRKY62表达中的作用，我们将他们在野生型植物中的表达与SA信号缺陷突变体pr1-3和sid2-3突变体(SALK_133146)中的表达进行了比较，SID2突变体在对SA生物合成至关重要的SID2基因中插入了T-DNA；

图1病原体和SA诱导的WRKY38和表达

wrky62。

  1. 病原体诱导WRKY38和WRKY62表达的时间过程。 用10mMMmgCl对5周龄拟南芥植株(Col-0)进行渗透2 或PSTDC3000(OD600 =0.0001在10米MgCl2)。 在接种后的指定时间收集浸润叶片进行RNA分离。 用a进行RNA凝胶印迹分析32电镀WRKY38探头。 用WRKY62探针剥离和重新检测印迹。 溴化乙锭染色的rRNA显示为评估等负荷。
  2. 病原体诱导的WRKY38和WRKY62表达的SA和NPR1依赖性。 用PstDC3000浸润5周龄野生型(Col-0)、npr1-3和sid2-3突变株。 对WRKY38和WRKY62表达进行叶片收集、RNA分离和RNA凝胶印迹分析(A)。
  3. SA诱导WRKY38和WRKY62表达的时间过程。 对5周龄的拟南芥植物(Col-0)进行喷水或SA(1mM)。 对WRKY38和WRKY62表达进行叶片收集、RNA分离和RNA凝胶印迹分析(A)。
  4. SA诱导的WRKY38和WRKY62表达的NPR1依赖性。 对5周龄野生型(Col-0)和npr1-3突变株喷洒1mMSA。 对WRKY38和WRKY62表达进行叶片收集、RNA分离和RNA凝胶印迹分析(A)。

这些实验进行了三次，结果相似。

在病原体感染的野生型植物中，WRKY62在8和12HAI处升高，而在病原体感染的SID2和NPR1突变体中则没有升高。 定量RT-PCR表明，野生型植物WRKY38和WRKY62转录本在8和12HAI时升高8到10倍，而在SID2和NPR1突变体中则没有升高（见补充图2在线）。 因此，毒力细菌病原体诱导WRKY38和WRKY62依赖于SA和NPR1。

为了进一步确定SA参与WRKY38和WRKY62的诱导，我们用水（对照）或1mMSA喷洒后，检测了它们在野生型植物中的表达。 由SA诱导WRKY38和WRKY62的表达，而不是由水诱导的(图1C)。 与病原接种植物不同，WRKY38和WRKY62的转录本在SA喷涂后4h升高，表明SA诱导它们的表达比PSTDC3000接种更快。 两个WRKY基因的转录本在SA喷涂后8小时内保持高度表达，然后下降到接近基础水平，如在病原体接种的植物中观察到的(图1C)。 在npr1-3突变体中，SA诱导的WRKY38和WRKY62的表达被完全消除(图1D)。 因此，SA诱导的WRKY38和WRKY62的表达是NPR1依赖性的。 表达数

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