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Current Microbiology
https://doi.org/10.1007/s00284-020-01913-8
使用改良的双级UASB生物反应器处理精制对苯二甲酸废水
Tayyibe Alpay1 ·Burcin Karabey1,2 · Nuri Azbar3 · Guven Ozdemir1
摘要
对串联两级上行厌氧污泥床(UASB)生物反应器的微生物群落动态及PTA废水降解性能进行了225天的研究。产酸反应器(R1)和产甲烷反应器(R2)的工作体积有6倍的差异。因此，反应器在不同的水力停留时间(HRT)条件下运行，有利于提高PTA废水含量。采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)和实时荧光定量PCR (Q-PCR)技术分析颗粒中的古细菌和细菌图谱。高压液相色谱(HPLC)结果显示，4-羧基苯甲醛(4-CBA)和乙酸(AA)在第一阶段降解完全，对苯二甲酸(TA)降解率为90%，对甲苯酸(P-TA)降解率为47%。气相色谱法测定UASB反应器的甲烷含量为76%。微生物群落分析表明，氢营养产甲烷菌群Methanobac- teriales和Methanomicrobiales在整个产甲烷过程中起主导作用。
引文
对苯二甲酸(PTA)废水以对苯二甲酸酯(TA)为主要成分，是世界50强化学品[1]之一。PTA一般用于石化工业生产聚酯纤维、pet瓶等产品。约每吨PTA生产可产生3 ~ 10 m3的高浓度PTA废水，化学需氧量(COD)为5 ~ 20 kg COD/m3[2]。对苯二甲酸(TA)、苯甲酸(BA)、对甲苯酸(p-TA)和乙酸(AA)是PTA废水[3]中毒性最强的化合物。
低浓度对苯二甲酸酯的好氧生物降解是一种有效且广泛应用于工业废水处理的技术[4-6]，但近年来厌氧消化技术因其经济优势而受到广泛关注[7,8]。此外，沼气生产是厌氧处理中一个重要的过程产量，使这些过程相当有吸引力。
PTA废水的处理需要先进的系统，因为PTA废水中含有易于在厌氧条件下降解的化合物(乙酸和苯甲酸)，而高强度的化合物(对苯二甲酸和对甲苯酸)需要较长的滞后时间[9]。除反应器设计外，温度是影响降解率的另一个参数。一般来说，PTA废水是在中温条件下操作的，但有几位作者报道，超中温(45-50°C)和高温(55-60°C)温度也可能更好[3,10]。
有研究表明，产酸细菌和产甲烷古菌群之间的共生联系对PTA废水组分的降解有很大作用。这些相互作用导致芳香族化合物完全转化为甲烷[11]。
因此，本研究采用两级厌氧反应器系统，研究了中温条件下TA、4-CBA和p-TA化合物的降解效率。利用基于16S rRNA的分子技术，探讨了不同HRT条件对反应器性能和微生物群落结构的影响。
材料和方法
实验设计和操作条件
依次连接250ml UASB反应器(R1)和1.5L UASB反应器(R2)，分别进行产酸和产甲烷反应。R2(产甲烷反应器)的工作体积是R1(产酸反应器)的6倍，因此，两个反应器之间HRT的差异是自然的6倍。玻璃反应器通过加热套在37-40°C的中温条件下维持。根据不同的HRT条件，蠕动泵控制进水流速，连续进水。厌氧颗粒污泥厌氧消化池获得种子的当地啤酒工厂位于土耳其伊兹密尔。颗粒污泥在接种R1 (1/4 (v/v))前进行研磨处理，未对R2 (1/3 (v/v))进行预处理。两个反应器均充入10%的基础培养基(v/v)和合成废水(其余)。
按运行顺序分别向反应器输入(i)合成废水、(ii)合成PTA废水和(iii)实际PTA废水。在自来水(每升)中加入葡萄糖5 g，NaHCO31g，24.8毫克K2HPO4，42.5毫克MgSO4·7H2O, 200mg NH4Cl, 13.0 mg CaCl2·2H2O、9.9 mg KH2PO4，和1ml微量金属溶液，制得合成废水。配制微量金属溶液在水中加入4.1 mg FeCl3.6H2O, 5.3毫克NiSO4.7H2O, 1.1 mg MnCl2 4H2O, 0.6毫克氯环己烷2.2H2O, 0.6 mgZnCl2，0.4 mg (NH4) 2 MoO4.4 H2O, 0.2mg NaBO2.10 H2O和0.3毫克CuCl2.2H2O每升。以乙酸(AA)、4-羧基苯甲醛(4-CBA)、对苯二甲酸(TA)、对甲苯酸(p-TA)代替葡萄糖合成PTA废水。60 d后，化合物浓度由121 ~ 500 mg/L (TA、p-TA、AA)和250 mg/L (4-CBA)逐步升高，而葡萄糖浓度由5 降低到 0 g/L。用1 N HCl[9]调节废水的最终pH为5.5，解决了化学品的溶解度问题。实际PTA废水来自土耳其伊兹密尔石化工业的污水处理厂。
操作参数如表1所示。简单地说，这个过程可以分为三个阶段。第一阶段以含5 g/L葡萄糖的合成废水为碳源，初始水力停留时间(HRT)分别为12 h和72 h。此投料速率使理论COD容积投料速率asymp;1.2 g-th COD /L.day。在第二阶段，葡萄糖浓度开始逐步降低，而其他化合物如TA、p-TA、AA和4-CBA从初始浓度121 mg/L开始增加。第三阶段运行时，将实际PTA废水引入系统，HRT为15 h，用于酸化反应器。在所有阶段结束时收集污泥样品，并保存在minus;20°C，直到用于进一步的分子分析。
解析分析
采用高效液相色谱(Agilent 1100)和二极管阵列(DAD)检测器，带有Agilent Zorbax Eclipse PAH分离柱，在220 nm和254 nm波长处检测TA、p-TA和4-CBA。流动相为乙腈(含0.1%甲酸)和水(30:70 v/v)。流量调整在1毫升/分钟和1micro;L的样本注入autosampler(安捷伦1100)。所有样品在分析之前，10000times;g离心3 min。
表1. 165天的操作参数变化
|
天数 |
对苯二甲酸(毫克/升) |
精制对苯二甲酸(毫克/升) |
醋酸(毫克/升) |
4-对羧基苯甲醛(毫克/升) |
荷尔蒙替 代疗法(h) R1 / R2 |
葡萄糖(g / L) |
|
|
第一阶段 |
0-60 61 - 120 |
- - 121 - 500 |
- - 121 - 500 |
- - 121 - 500 |
- - 121 - 250 |
12/72 12/72 |
5 5-0 |
|
第二阶段 |
121 - 140 141 - 178 |
500 625 |
500 500 |
500 50 |
250 25 |
15/90 18/108 |
0 0 |
|
179 - 190 |
625 500 实际PTA废水 |
50 |
25 |
21/126 |
0 |
||
|
第三阶段 |
191 - 204 205 - 212 |
531 531 |
230 230 |
80 80 |
5 5 |
21/126 15/90 |
0 0 |
|
213 - 225 |
531 |
230 |
80 |
5 |
12/72 |
0 |
|
葡萄糖和化学药品的浓度分别逐步降低/增加。根据化学需氧量分析改变HRT条件
化学需氧量(COD)通过COD细胞试剂盒(CSB- 1.14895.0001, WVR)来间接测定。
采用气相色谱法(GC) (6890 N Agilent)，热导检测器和Hayesep d80 /100填充柱测定气相甲烷含量。检测器、注入器和烘箱温度分别维持在150°C、150°C和35°C。以氩气为载气，流速为20 mL/ min, 5 mL气样注入[12]。
微生物群落分析
DNA提取
颗粒污泥样本用探测类型声波降解法处理10s变得均匀,三个周期70%效能(Bandelin SONOPULStrade;通用2070数字超声波均质器、德国)接着离心3分钟7000times;g以达到更高的数量来自不同有机体的DNA，位于内部的颗粒。根据制造商的程序(MO-BIO, Carlsbad, CA USA)，使用Power Soil DNA分离试剂盒进行DNA提取。纯化后的DNA用Nan-odrop2000c分光光度计(Thermo scientific, U.S.A)进行定量，并在minus;20°C保存直到使用。
实时定量PCR (qPCR)分析
采用克隆方法构建质粒标准曲线进行定量分析。为此，用每种细菌、古细菌和产甲烷菌[13]的特定引物扩增总基因组DNA样本。扩增方案步骤如下:初始变性，95℃1个循环，2min;和扩增, 循环35次条件如下， 95°C 20s,58°C 40s, 72°C 30s,最终在72°C扩展5分钟。PCR反应的温度对于16 s rDNA使用相同的执行程序与不同的退火温度(57°C适用于所有古细菌引物)和扩展时间(ARC15s，MSL25s，MMB30s)。利用琼脂糖凝胶(1.5%的琼脂糖,1 X TAE缓冲在90 V 1 h)分析了PCR产物并且预期大小的DNA带(Bacteria-BAC468个基点,为甲烷八叠球菌属354个基点——les-MSL Methanomicrobiales-MMB 506个基点,为Methanobacteriales-MBT 343个基点,273个基点,古生菌-弧)用DNA琼脂糖凝胶萃取试剂盒提取和纯化。 (罗氏诊断,曼海姆,德国)。根据制造商的说明，最终产品克隆到pGEM-T Easy载体(Promega, Mannheim, Germany)。质粒分离后，用MOBAM (Gazi University, Ankara, Turkey)对16S rRNA基因插入片段进行测序。基本局部对齐搜索工具利用国家生物技术信息中心(NCBI GenBank)数据库内的(BLASTn)项目进行序列比较。
根据已知质粒浓度102 -109 基因复制建立标准曲线[14]。使用Lee等人[15]的公式计算相应的拷贝浓度。采用LightCycler 1.5 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)系统和LightCycler TaqMan Master kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)进行qPCR分析。总量20micro;L的聚合酶链反应混合物由1micro;L TaqMan探针(最终浓缩的0.1毫米),2micro;L引物混合物(最终浓缩的0.6毫米),4micro;L 5times;反应缓冲区,20 ng的DNA模板,和8micro;L PCR-grade水。扩增方案步骤如下:初始变性，95℃10 min, 1个循环;扩增，95°C 10 s, 58°C 30 s, 72°C 1 s 40个循环;在40°C冷却30 s。
PCR – DGGE分析
采用美国Bibby Scientific公司的Techne TC- Plus热循环仪进行聚合
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