丝状真菌的几丁质酶:一大类具有多种生理功能的蛋白质外文翻译资料

 2022-08-08 11:09:47

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丝状真菌的几丁质酶:一大类具有多种生理功能的蛋白质

摘要

几丁质是第二丰富的天然生物聚合物，它是无脊椎动物外骨骼和丝状真菌细胞壁的主要结构成分。真菌几丁质酶在菌丝生长过程中具有多种生理功能，包括降解外源几丁质和重塑细胞壁。随着在过去几年中真菌基因组测序项目的数量不断增加，我们能够更好地评估真菌几丁质酶的整个范围和多样性。本篇综述介绍了丝状真菌几丁质酶的种类、结构域和亚群，并讨论了这些数据与几丁质酶分子生物学研究数据的整合。

关键词

N-乙酰氨基葡萄糖酶，细胞壁改造，几丁质酶，几丁质降解，真菌，重寄生。

  1. 介绍

几丁质是一种由乙酰化氨基糖N-乙酰葡萄糖胺的beta;-1,4连接亚基组成的线性、不溶性均聚物。自然界中存在两种主要类型的几丁质，其特征是N-乙酰氨基葡萄糖链的反平行(alpha;-几丁质)或平行(beta;-几丁质)排列(图1)。几丁质是生物圈中发现的第二丰富的聚合物，含量仅次于纤维素(Tharanathan amp; Kittur, 2003)。它是无脊椎动物外骨骼的主要化合物，也是丝状真菌细胞壁的重要结构成分。

图1 (a)几丁质的化学结构（灰框表示几丁质链的一个N-乙酰氨基葡萄糖亚基）

(b)两种主要类型的几丁质的特征是链的反平行(alpha;-几丁质)或平行(beta;-几丁质)排列

以前对真菌几丁质酶的综述已经强调了这些酶的多样性以及它们在真菌中的多种功能（Gooday 1990;Jolle s amp; Muzzarelli 1999）。然而，直到最近真菌基因组测序项目的出现才使我们能够评估真菌几丁质酶的整个范围和种类（http://genome.jgi-psf.org/mic_home.html;http://www.broad.mit.edu/seq/msc/）。虽然在细菌基因组数据库中，平均只能找到2到4种几丁质酶，但丝状真菌的基因组通常包含10到25种不同的几丁质酶。真菌产生如此多几丁质酶的原因尚不清楚。真菌几丁质酶的潜在生理作用，如之前的综述（Adams 2004;Cohen-Kupiec amp; Chet 1998;Duo-Chuan 2006;Gooday 1990;Jolle s amp; Muzzarelli 1999;Yang等,2007）所述，包括：(i)存在于死亡菌丝碎片的真菌细胞壁或死节肢动物的外骨骼中的外源性几丁质的降解，并将降解产物用作营养源;(ii)真菌生命周期中的细胞壁重塑，包括几丁质酶在菌丝生长、分枝、菌丝融合和自溶过程中的假定作用;和(iii)在真菌生存环境中与其他真菌或节肢动物的竞争和防御。有些真菌甚至进化出了利用几丁质酶积极攻击其他真菌(真菌寄生)、昆虫(昆虫病原真菌)或线虫(诱捕线虫真菌)的生活方式。

这篇综述旨在强调我们在过去几年中从不断增加的真菌基因组序列中了解到的关于几丁质酶的经验教训，以及这些数据是如何与几丁质酶的分子生物学研究中已有知识相结合的。

  1. 几丁质降解酶的机制

几丁质水解酶可分为N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和几丁质酶，这两种酶的裂解模式有很大的不同(图2)。N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(酶代码EC 3.2.1.52)催化甲壳素末端非还原的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基的释放，但通常它们对二聚体N,Nrsquo;-二乙酰基二糖(GlcNAc)2的亲和力最高，并将其转化为两种单体(Horsch等,1997)。根据CAZy分类(碳水化合物活性酶数据库,Coutinho amp; Henrissat 1999;http:// www.cazy.org)，N-乙酰氨基葡萄糖苷酶属于糖苷水解酶(GH)20家族。重要的是，这些酶不能被称为外几丁质酶，不幸的是，这在文献中经常被混淆。相比之下，几丁质酶(酶代码EC 3.2.1.14)属于GH家族18和19，催化几丁质和壳寡聚物的beta;- 1,4键水解，从而释放短链壳寡聚物。GH家族18和19不具有序列相似性，具有不同的三维结构(Kezuka等,2006;Perrakis等,1994;Terwisscha van scheltinga1996;van Aalten等,2000)以及不同的催化机制，其中GH 18几丁质酶产生szlig;-异构体产物(保留机制,Brameld，1998)，而GH 19几丁质酶产生alpha;-异构体(反转机制,Brameld amp; Goddard 1998)。此外，根据其裂解模式，几丁质酶可分为内切几丁质酶和外切几丁质酶(图2)。内切几丁质酶从聚合物链上任意一点降解几丁质，形成任意长度的产物，外切几丁质酶从非还原链端裂解，释放的产物为(GlcNAc)2。然而，几丁质酶的酶学性质比外/内分类所反映的更加复杂和多样。对粘质沙雷氏菌的几丁质酶解系统的详细研究证明了另一种分类几丁质酶性质的方法，通过将它们分为连续酶和非连续酶(如horn等,2006;Sorbotten等,2005;Uchiyama等,2001)。连续几丁质酶在水解裂解后并不释放底物，而是通过活性位点隧道将其滑入下一个裂解步骤。碳水化合物结合域的存在可以增强过程性，但不是必需的。非加工性几丁质酶水解后与底物完全解离。这导致了中链(6-30mer)产物均匀分布的非处理酶对底物的降解模式，处理酶对残多聚底物残余物的降解模式，以及仅2-8mer短链降解产物的降解模式(Horn等,2006)。

图2 几丁质酶主要裂解模式示意图（几丁质链的亚基单位显示为浅蓝色；还原糖显示为深蓝色；虚线表示聚合物基质比图中显示的长。）

几丁质酶含有多种碳水化合物结合模块(CBM)。这些CBM包括不同的家族，经典定义为几丁质和纤维素结合域，这是由于它们对这些碳水化合物的偏好亲和力(Henrissat 1999)。这些CBM的扩展数据、分类和应用可在最近的综述中找到(Borast等,2004;Shoseyov等, 2006)和碳水化合物结合模块家族服务器(http://www.cazy.org/fam/acc_CBM.html)。

  1. 真菌的几丁质分解酶的机制
  2. 通过对基因组数据进行电子分析来完成图片

迄今为止，对超过25种真菌基因组的分析表明，真菌几丁质酶只属于GH18家族。GH 18酶不仅存在于真菌中，还存在于细菌、动物、病毒和植物中。它们传统上被分为三类和五类，由于它们在选定的生物体中存在，也被称为真菌/植物(三类)和真菌/细菌(五类)几丁质酶。第三类和第五类几丁质酶的底物结合囊的结构不同(Terwisscha van Scheltinga等,1994;van Aalten等,2001)。第五类(细菌型)酶具有较深的、隧道状的底物结合槽，第三类(植物型)酶具有较浅的、开放的底物结合槽。因此，第五类酶显示出外作用活性(对应于加工酶)，而第三类酶是内切几丁质酶(非加工酶)(Hoell,2005;hurt ado-Guerrero amp; van Aalten 2007;Jaques等,2003)。

第一代基于基因组序列数据的壳聚糖降解酶的完整列表是在红褐肉座菌（T.reesei）（Seidl等,2005）中进行的。它揭示了18个编码几丁质酶的开放阅读框(ORFs)和另外两个编码低相似性GH 18蛋白的开放阅读框的存在，表明以前的研究方法错过了2/3以上的半胱氨酸蛋白酶/丝裂霉素酶。与此相反，编码这两个直系同源物的开放阅读框缺失了已经描述的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的2/3以上的低糖/木霉基因，并且只有一个与N-乙酰氨基己糖苷酶有远亲关系的额外假设蛋白质，是红褐肉座菌基因组数据库中唯一可以检测到的GH 20蛋白。这些发现反映了具有注释基因组的其他真菌的相似情况，如：粗糙脉孢菌、稻瘟病菌、曲霉属、镰刀菌属、灰霉病菌、菌核病菌等，其具有大量几丁质酶的ORF(约10–25,GH 18)，但只有2-3个ORF编码beta;-N-乙酰己糖胺酶(GH 20)。这表明几丁质酶而不是N-乙酰氨基葡萄糖苷酶决定了真菌几丁质解聚潜力，并且是调节几丁质降解不同方面的关键因素。然而，不同真菌中几丁质酶的总数是高度可变的，从例如玉米黑粉菌中的两种几丁质酶到尖孢镰刀菌中的27种几丁质酶不等。然而，在大多数子囊菌和担子菌中，每个物种平均可以检测到15种不同的几丁质酶编码基因。

  1. 分组

对真菌基因组中编码几丁质酶的ORF进行筛选，发现这些蛋白质的多样性甚至比先前预期的更大。对已测序真菌基因组中几丁质酶的系统发育分析表明，它们可分为三个不同的亚组(图3,Seidl等,2005)。亚组A和B(分别对应于第五类和第三类)包含所有先前鉴定的真菌几丁质酶，而亚组C包含一组尚未在丝状真菌中描述的新型高分子量几丁质酶。

图3 真菌几丁质酶的结构域组织

SP：信号肽 BD：结合域

A亚组：

A亚组几丁质酶含有一个催化结构域，但不含CBM，平均分子量为40-50 kDa。A亚组几丁质酶存在于所有真菌基因组中。平均来说，每四个A亚组几丁质酶有六个担子菌，但取决于真菌含有的几丁质酶总数量，数量范围从玉米黑粉菌中的两种几丁质酶到玉米尖孢霉中的12种几丁质酶.真菌界中最保守和表达最丰富的几丁质酶可在含有红褐肉座菌CHI18-5（ECH42）的A亚组分支中找到，迄今为止研究的大多数几丁质酶都属于该分支(另见第4节)。许多A亚组几丁质酶具有将它们靶向分泌途径的N-末端信号肽，因此是细胞外蛋白，但一些被预测为细胞内蛋白或具有内质网靶向序列(例如:构巢曲霉 EAA66094、粗糙链孢霉 XP_959610、红褐肉座菌 DAA05852、小麦赤霉 EAA76014)。

B亚组：

B亚组几丁质酶的大小和结构域变化很大，分子质量在30-90 kDa之间。它们可以分为小的B亚组几丁质酶(30-45 kDa)和90kDa左右的大蛋白，B亚组几丁质酶（30-45kDa）经常含有CBM，这是A亚组几丁质酶中完全不存在的一种特性，B亚组几丁质酶具有长的、无结构的、富含丝氨酸/苏氨酸的结构域和/或GPI锚定信号，表明成熟蛋白结合到质膜上。CHIA·构巢病就是GPI锚定几丁质酶的例子，据报道它参与细胞壁重塑过程(Takaya等,1998)。

不同真菌种之间的B亚组几丁质酶的数量差异很大。在大多数真菌基因组中(如粗糙链孢霉、格氏菌、构巢曲霉、木霉菌、稻瘟病菌、禾生球腔菌和球虫菌）。担子菌(二色漆酶、黄孢原毛平革菌、胎盘)中仅存在2-3个编码B亚组几丁质酶的ORF，镰刀菌甚至只有一个编码B亚组几丁质酶的ORF，而在黄瓜担子菌和蔷薇担子菌的基因组中完全没有B亚组几丁质酶。与此相反，许多真菌，如灰霉属/木霉属(红褐肉座菌,阿托维氏竹红菌,尿素病毒)，曲霉属(烟曲霉、棒孢曲霉、新孢子虫)和米根霉具有多达五个B亚组几丁质酶。这表明这些额外的几丁质酶在各自的真菌中有特殊的功能。其中一些蛋白质甚至在系统发育上属于分离的分支，该分支还包括昆虫病原真菌甲基苯丙胺中描述的直系同源物，表明其在几丁质降解中具有特殊功能。

真菌基因组序列分析证实，许多小的B亚组几丁质酶(30–45kDa)具有CBM，但这些结构域因真菌种类而异。子囊菌灰霉属/木霉属(红褐肉座菌,绿矮菌,阿托维氏竹红菌) 和硬化链霉菌具有几个有CMB1结构域的B亚组几丁质酶。目前为止，只对含有CBM的两个B亚组几丁质酶进行了详细的研究，两者都具有CBM 1结构域(Baratto等,2006;Kim等,2002)。这些类型的CMB传统上被称为纤维素结合域（CellBDs），仅在真菌中发现。然而它们似乎具有更广泛的多糖结合谱，并且据报道它们也能与几丁质结合(Boraston等,2004)。Limon等(2004)从纤维二糖脱氢酶Ⅱ中添加细胞色素D (CBM1)。将红褐肉座菌(里氏木霉)与白腐真菌（哈茨木霉）的CHI18-12(CHIT33)和CHI18-5(CHIT 42)，获得具有更强几丁质结合能力的酶。在其他真菌中，例如合子菌属和担子菌属，胎盘几丁质酶和金孢子菌，B亚组几丁质酶的CBM属于家族5/12，最初也被分类为链状芽孢杆菌。有趣的是，在白杨属中只有少数B亚组几丁质酶具有CBM。烟曲霉、棒曲霉和稻瘟病菌各有一个具有CBM 19的B亚群几丁质酶(被描述为具有几丁质结合功能)，但是在黑曲霉、构巢曲霉、土曲霉、黄曲霉和费希新萨托菌的B亚群几丁质酶中没有发现CBM。

C亚组：

C亚组是真菌几丁质酶的一个新亚组。该亚群中描述的第一种几丁质酶是绿脓杆菌（阿托维氏菌属）CHI18-10（Seidl等,2005）。C亚组几丁质酶的分子量通常为140-170 kDa，尽管其尺寸较大，这已通过例如阿托维氏竹红菌chi 18-10的cDNA测序得到证实(Seidl等,2005)，但它们有一个将其靶向分泌途径的N端信号肽。此外，C亚组几丁质酶包含几个特征，这些特征使其明显区别于其他真菌几丁质酶。它们具有一个几丁质结合域(CBM 18)和多个LysM基序，这些基序是短肽结合域，内含于结合肽聚糖和结构相关分子，如细菌和真核蛋白质中的几丁质(Ohnuma等,2007;Zhang等,2007)。植物几丁质酶PrChi-A的LysM结构域对该蛋白的抗真菌活性至关重要(Onaga amp; Taira,2008)。

不同真菌种间的C亚组几丁质酶数量差异很大。虽然许多子囊菌有许多C亚组几丁质酶，如禾谷镰刀菌(约7)，巢穴镰刀菌(约9)，红球蜜环菌(约10)和绿色念珠菌(约12)，但其他子囊菌只有少数几类几丁质酶，如厚壳酵母(3)，革兰氏菌(2)，稻瘟病菌(

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