在工艺条件下，解脂耶氏酵生产重组蛋白的高效表达载体和宿主菌株外文翻译资料

 2022-08-08 11:10:01

英语原文共 12 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

在工艺条件下，解脂耶氏酵生产重组蛋白的高效表达载体和宿主菌株

摘要

背景：油酵母脂溶菌越来越多地被用作生产重组蛋白的替代细胞工厂。 最近，EYK1和EYD1基因的调控启动子，分别编码赤藓酮糖激酶和赤藓酮糖醇脱氢酶，已在该酵母中被鉴定和表征。 基于EYK1(UAS1)上游激活序列的串联拷贝，开发了由赤藓酮糖醇和赤藓酮糖等多元醇上调的杂交亲代eyk1和XPR2(编码细胞外蛋白酶，UAS1xpr2)推动者。

结果：以南极假丝酵母细胞外脂肪酶CALB为模型蛋白和一种新的专用宿主菌株，比较了天然启动子(pEYD1)和工程启动子(pEYK1-3AB和pHU8EYK)的强度。 后者是在多元醇代谢中设计的，并允许有针对性的染色体整合。 在工艺条件下，工程启动子pEYK1-3AB和pHU8EYK的蛋白质生产率分别提高了2.8和2.5倍

参考pTEF启动子。 我们还证明了在新开发的宿主菌株中多拷贝集成的可能性。 在间歇生物反应器中，CalB多拷贝菌株Riy406导致脂肪酶生产率增加1.6倍45,125UML-1与单拷贝菌株相比，在24小时内。

结论：本文所描述的表达系统对于重组细胞外蛋白在解脂耶氏酵母中的表达具有广阔的应用前景。

关键词：启动子、调节、诱导、合成启动子、叶三醇、蛋白质分泌、上游激活序列、脂多糖、CalB

解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica越来越多地被用作酿酒酵母或Pichiasteris等模型酵母的替代品。用于生产重组蛋白[1, 2]。 已经高产出了一百多种异源蛋白质，突出了其作为细胞工厂的潜力。也被证明能够有效地生产化学物质，如柠檬酸[3 衣康酸[4[.]红血球[5赤藓酮糖[6生物柴油和生物喷气燃料的脂质[7, 8]. 在自然界，解脂耶氏酵母可以生长在富含脂质和蛋白质的环境中，因为它能够合成和分泌水解酶， 如蛋白酶或脂肪酶[9, 10]。 基于这些代谢特征，几种工程工具，如强启动子和有效的排序信号，包括LIP2的prepro序列编码细胞外脂肪酶的基因已经被开发来自编码碱性细胞外蛋白酶的XPR2基因的启动子是首次开发用于重组基因表达[12]。对其功能的解剖导致了上游识别序列(UAS1XPR2)的激活，后来用于构建组成型混合启动[13]。 这些都是基于UAS1XPR2重复系列在最小LEU2启动子上游的融合[14,15]. UAS1xpr2个数的重复被发现可以调节启动子的强度，从而允许基因表达的微调。还应用了一种类似的策略来设计来自TEF1基因的本构启动子， 该基因编码翻译伸长因子1alpha;[16]。来自分别编码细胞外脂肪酶和酰基-CoA氧化酶的LIP2和POX2 基因的调节启动子也被开发用于重组基因的表达[17]。虽然这些受调控的启动子提供了较强的基因表达，但其在工业规模上的利用受到其诱导剂（即甘油三酯和脂肪酸）的疏水性质的阻碍。最近，我们对两个基因进行了表征，即EYD1和EYK1，它们参与了赤藓糖醇分解代谢途径[6, 18]。 基因EYD1被发现编码一种能够将赤藓糖醇转化为赤藓酮糖的赤藓酮糖脱氢酶，而基因EYK1被建议编码一种赤藓酮糖激酶。 在赤藓糖醇或赤藓酮糖存在下，EYK1天然启动子(pEYK300)的诱导显著增加，且在甘油和葡萄糖存在下急剧少。此外，我们还证明了赤藓酮糖是比赤藓糖醇更好的诱导剂[19]。EYD1基因编码赤藓糖醇能够将赤藓糖醇转化为赤藓酮糖的脱氢酶，而EYK1基因被认为可以编码红酮酶激酶。EYK1天然启动子(pEYK300)的诱导解剖EYK1promoter强调了两种UAS的存在，即UAS1EYK1，UAS2EYK2 。使用基于报道系统的在黄荧光蛋白(YFP)和突变的pro启动子上，UAS1EYK1被鉴定为启动子。赤藓糖醇和赤藓酮糖诱导。相比之下,UAS2EYK1被发现参与了葡萄糖的抑制作用。合成促进剂是通过添加UAS1EYK1或UAS1XPR2的多个拷贝天然pEYK300启动子。Tese启动子比野生型pEYK300启动子分别高表达3.2倍和15.6倍的yfp编码基因[19]. Carly等人[6, 18]发现EYK1基因的破坏损害了酵母细胞完全代谢赤藓糖醇的能力，因为一个eyk1Delta;突变体只能将赤藓糖醇转化为赤藓酮糖。 因此，有了这样一个突变体，赤藓糖醇和/或赤藓酮糖可以作为一种自由诱导剂，如前面所证明的[19]。以红星荧光蛋白为基础的报告系统进行了推进工程的努力[20]. 它涉及UAS1的影响eyk1 野生型和eyk1Delta;突变体启动子强度的重复序列和核心元素(EYK1，TEF）
根据先前的结果，三个启动子，即pEYK1-3AB， 它包括UAS1的三个重复序列eyk1 ，包括8份UAS1xpr2来自XPR2基因和EYD1基因的天然启动子似乎有望驱动

EYD1产生重组蛋白[19,20]。 在此，这些启动子被挑战在工艺条件下生产一种工业感兴趣的蛋白质，即来自南极念珠菌的脂肪酶CALB。为此，对ProCalB核酸序列进行了密码子优化。脂溶性与LIP2基因的分泌信号融合，在启动子pEYD1、pEYK1-3AB、pHU8EYK和强构造启动子PTEF的控制下克隆。然后在一种新的宿主菌株中引入不同的CalB表达盒，该菌株专门用于赤藓糖醇/赤藓酮糖诱导表达系统。对于不同构建的菌株，在工艺条件下，在生物反应器培养过程中，对CalB基因的表达和细胞外活性进行了监测。

方法

培养基和培养条件

大肠杆菌菌株生长在37°C的Luria-Bertani培养基中，辅以卡那霉素硫酸盐(50micro;g mLminus;1)。解脂耶氏酵母在28amp;#176;C下，在YPD培养基中或YNB培养基中（1.7g/L不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮基，YNBww（水解乳蛋白，富兰克林湖，新泽西州，美国）），50毫米磷酸盐缓冲液PH6.8，补充碳源和氮源，如巴斯和盖拉尔所述[21].对于YNBD培养基，葡萄糖10gLminus;1和氯化钠5克Lminus;1加入到YNB培养基中。对于YNBE培养基，赤藓糖醇10gL-1和氯化钠5克L-1加入到YNB培养基中。对于YNBGE培养基，甘油10gL-1，赤藓糖醇10gL-1，酵母提取物5克L-1(酵母提取物UF，BDDifco)，大豆5克L-1(选择大豆，BDDifco)加入YNB培养基。恩伯格除含有甘油20g/L外，E介质与YNBGE相同。培养基中含有赖氨酸(0.08%,w/v)和/或尿嘧啶(0.01%，w/v)，以满足营养需求。 红霉素(200micro;g mLminus;1)被添加用于转化剂的选择。固体培养基含琼脂1.5%(w/v)。磷酸盐缓冲盐水(PBS)含有NaCl8gL-1，KCl0.2gL-1，亚磷酸钠1.44gL-1和亚磷酸钾0.24gL-1。生物反应器中的培养物最初接种光密度在600nm(OD600在YPD培养基中，用PBS洗涤细胞，在16小时前培养0.5个。在2Mag生物反应器（德国慕尼黑）中进行培养，一式三份，在10mL的YNBGE培养基中进行48小时，搅拌设定为800rpm。在DASGIP生物反应器(DASboxMini生物反应器SR0250ODLS，Eppendorf，汉堡，德国)中进行培养，一式两份，在YNBG的150mL中进行48h2补充500micro;L L-1的E介质消泡剂(TegoKS911，Evonik，Essen，德国)。气流设置为1VVM，搅拌范围为800~950rpm，以确保溶解氧水平高于20%，pH自动调整为6.8

通过添加磷酸在2mLYNBG中进行了8M或NaOH12.5M的Duetz深井板(24孔板具有锥体底部，KuhnerAG，Birsfelden，瑞士)的培养基培养48h；接种200mu;L的24h预培养物输出在400micro;LYPD48孔孔板(多孔电池培养板，脂肪底，tc处理VWR, Radnor，PA，美国)24小时。

菌株和质粒构建
本研究采用标准分子遗传技术[22]. 限制酶是从新英格兰生物实验室(MA，美国)获得的。在应用生物系统2720热循环器中进行PCR扩增，其中GoTaqDNA聚合酶(Promega，WI，美国)或Q5高保真DNA聚合酶(新英格兰Biolabs)。用QIAgen纯化试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国) 纯化PCR片段，用QIAprep自旋Miniprep试剂盒(QIAGEN)分离质粒DNA。

本研究中使用的所有菌株和质粒列于表1.
用于构建JMY7126(图1）根据Fickers等人的说法，LYS5和EYK1被PUT磁带破坏。[23]对于LYS5的破坏，分别用引物对LYS5-P1/LYS5-P2和LYS5-T1/LYS5-T2进行PCR扩增基因的启动子(P)和终止子(T)区。引物LYS5-P1和LYS5-T2含有NOTI限制性位点序列，而引物LYS5-P2和LYS5-T1含有I-SceI限制性位点序列(表2).对相应的扩增子进行纯化，并作为第二个PCR步骤的模板，得到PT片段，纯化后克隆到pCR4Blunt-TOPO质粒(Invitrogen，CA，美国)。最后，在该质粒的I-SceI位点引入JMP1046的URA3ex标记，得到质粒JMP3267。用JMP3267的非I消化得到的LYS5PUT盒子进行Y的变换。脂解菌株JMY1212产生JMY5207(图1。1)的

通过对YNBD和YNBD-赖氨酸的生长素检查，证实了LYS5的破坏。在该菌株中，URA3EX标记被CRE重组酶的瞬时表达所挽救，使用复制质粒JMP547,如前所述[23].在所得到的菌株JMY7121中，EYK1通过非I消化从质粒RIE124中获得的PUT盒被破坏。用引物对前TEYKFw/后PEYKRv和YNBD-赖氨酸和YNBE赖氨酸的生长进行菌落PCR验证了EYK1的破坏。这导致JMY7123菌株与质粒RIE132进一步转化,以切除URA3EX标记。这导致最终菌株JMY7126(表1，1)。在补充或不补充的YPD上，通过复制电镀检查复制质粒的丢失用潮霉素治疗JME547，或用YNBD和YNBE治疗RIE132。为了恢复LYS5原生质体，用NOTI消化得到的质粒RIE279表达盒对菌株进行转化，并利用引物LPR-R和LYS5PR进行菌落PCR验证基因整合。JMP1046为原料，用诱导启动子(分别为pEYK1-3AB、pHU8EYK1、质粒JMP4123和JMP4001)
代替PTEF，用ClaI和BamHI消化并随后结扎，构建了赤藓醇诱导质粒由JMP1046通过诱导型ible启动子取代pTEF(即pEYK1-3AB, pHU8EYK1，质粒分别为JMP4123和JMP4001)用ClaI、BamHI和随后的liga进行消化。这里，Trassaert等人描述了pEYK300A3B。根据帕克的说法，[19]改名为pEYK1-3AB
et al .[20]。TeY.lipolytica LIP2 pre-CalB pro-CalB通过生物催化剂有限公司进行密码子优化(Cardiff，UK)，由Geneart合成(Regens-burg，Germany)。优化合成基因(15ACCYPP_1762989_LIP2-CalB-Yl-Opt)的序列显
示在附加文件中1表S1。将LIP2PreCalBpro-CalB基因(CalB)克隆到JME1046(pTEF)、JME4266(pEYK1-3AB)和JME4230载体中(pHU8EYK)在BamHI/AvrII限制性位点(图2). 为了获得pEYD1-CalB结构，在Y的基因组DNA

上，用PCR获得的pEYD1交换质粒JMP4365中的启动子pEYK1-3AB。用引物ClaI-pEYD1-Fw和BamHI-pEYD1Rev和随后的酶切用ClaI和BamHI。为了构建质粒JME4579，通过I-SceI消化和连接，将URA3ex标记与LYS5ex标记交换。通过对相应质粒的NOTI消化得到基因表达盒，并用于转化Y。脂解菌株JMY7126采用醋酸锂方法，如前所述[24].

分析方法
细胞生长监测
在600nm(OD)下，用光密度监测细胞生长600，一单位OD600对应于0.29克干电池重量(DCW)。

定量分析CalB基因表达
如上文所述，进行RNA提取和cDNA合成[17]。在2.2times;107菌株JMY7536、JMY7539、JMY7544和JMY7548的细胞24小时后在2Mag生物反应器中培养。用引物对CalB-内部-FW/CalB-内部-R2和ACT-F/ACT-R(表2分别用于CalB和肌动蛋白基因）相对于肌动蛋白基因的表达水平，calB基因表达水平标准化[17]。实验一式三份。

脂肪酶活性
根据Fickers等人的说法，通过监测对硝基苯丁酸(p-NPB)的水解，测定了培养上清液中脂肪酶活性。[25]将溶解在乙腈(20%v/v)中的p-NPB加入最终浓度为1mM的100mM磷酸盐缓

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[258497]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word

原文和译文剩余内容已隐藏，您需要先支付 30元 才能查看原文和译文全部内容！立即支付

以上是毕业论文外文翻译，课题毕业论文、任务书、文献综述、开题报告、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。

您可能感兴趣的文章