稳定且可溶的生物催化剂的计算机设计外文翻译资料

 2022-08-08 11:14:28

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稳定且可溶的生物催化剂的计算机设计

摘要:

天然酶是一种精细的生物分子，仅具有边缘的热力学稳定性。稳定性差、错误折叠和聚集的蛋白质在生物技术和生物制药行业中导致巨大的经济损失。因此，需要设计优化的蛋白质序列，其在不同组成的缓冲液中和在有机助溶剂的存在下，在较宽的温度和pH值范围内最大化稳定性，溶解性和活性。这引起了人们对使用计算方法来增强生物催化剂的坚固性和溶解性的极大兴趣。合适的方法包括能量计算，机器学习，系统发育分析以及这些方法的组合。在过去的二十年中，我们目睹了稳定酶设计的惊人进步，但是对蛋白质溶解度和表达能力的预测却很少。稳定的突变可以使用可用的力场准确地预测，并且可用于系统发育分析的序列数量正在增长。此外，复杂的计算工作流程正在直观的网络工具中实施，从而提高了蛋白质稳定性预测的质量;相反，溶解度预测因子受到缺乏稳健且平衡的实验数据，对蛋白质聚集基本原理的理解不足以及蛋白质表达受限的限制。缺少折叠中间体的结构信息。在这里，我们总结了用于预测蛋白质稳定性和溶解性，严格评估其优缺点以及确定数据和知识中明显差距的计算工具的最新进展。我们还介绍了计算机设计稳定且可溶的生物催化剂的观点。

关键词: 聚合，计算机设计，力场，表达性，机器学习，系统发育分析，酶稳定性，酶溶解性

  1. 引言

大自然已发展出多种多样的生化反应，这些反应对于活生物体的不断进化和生命的维持至关重要。酶是活细胞中最重要的催化实体，并且能够共同催化广泛的生化反应。下一代测序的出现以及生物信息学以及分子和结构生物学的最新进展，使人们可以立即获得这些丰富的遗传信息资源，有助于鉴定适用于各种应用的有效生物催化剂。 此外，蛋白质工程领域已经成熟到可以定制天然酶用于特定实际应用的水平。但是，酶序列的重新设计通常会产生意想不到的次要作用，从而经常降低目标酶的溶解度和稳定性。减轻或消除这些负面影响的策略包括伴侣蛋白缓冲，蛋白结构的化学修饰，蛋白固定，培养基工程，融合蛋白的添加以及通过蛋白工程引入稳定或增溶突变。突变策略特别令人感兴趣的是“定向进化”，它是指通过将分子多样性的产生与选择或筛选过程相结合来模拟自然进化的实验方法。 然而，酶序列空间的庞大性阻碍了对所有可能的突变组合的全局评估，从而经常导致优化轨迹陷入进化的死胡同中，这限制了仅靠定向进化来创造稳定且可溶的生物催化剂的范围，并且需要知识 指导的方法来导航突变空间。合理的蛋白质设计策略可以通过整合现有信息，大大减少成功进行定向进化所需的实验工作。近来，半定向策略将定向进化与结构和序列数据相结合，以帮助确定适合于集中筛选工作的突变热点。

这一观点提供了有关临时数据集和用于增强酶稳定性或溶解性的蛋白质重新设计工具的全面概述。酶活性的保存在所有蛋白质工程项目中都是至关重要的，但是，高活性和稳定的催化剂在进化上是不利的，因为它们可能破坏宿主生物的体内平衡或干扰细胞复杂的代谢调控网络。大多数天然酶在次优条件下运作，为进一步优化留有相当大的空间（表1）。不幸的是，提高活性常常以降低酶稳定性为代价。本文介绍的蛋白质重新设计工具提供了避免这种折衷的方法，也使多肽增溶，从而促进了天然酶的有目的地适应。在这里，我们概述了通常用于分析蛋白质稳定性和溶解性的方法的理论框架。我们还严格审查可用于预测目的的数据集和软件工具。这一观点旨在从用户的角度评估工具，这些用户通常对准确性，可靠性，用户友好性以及底层方法的优缺点感兴趣（表2）。我们还提出了对现有知识差距的个人看法，并提出了未来发展的可能方向。

表1 稳定且可溶的生物催化剂的成功计算机设计的实验验证案例

稳定生物催化剂

酶| UniProt ID 底物 方法j 突变码 突变a wild-type Tm Delta;Tm t1/2c specifific activity kcat/Kmc ref

[°C] [°C]

角质酶| 52

丁酸4-硝基苯酯

力场

变体10

7 of 197

62.3

5.7

12.9times; (60 °C)

0.64times; (25 °C)

n.d.d

41

42

43

44

31

45

角蛋白酶| Q1EM64

角蛋白

机器学习

四倍

突变体

4 of 379

n.d.

n.d.

8.6times; (60 °C)

n.d.

4.11times; (40 °C)

腺苷酸激酶|P16304

Mg/ATP, AMP

系统发育（ASR）

ANC1

66 of 218

53.6

35.4

n.d.

n.d.

1.79times; (25 °C)

beta;-内酰胺酶P62593

苄青霉素

系统发育（CD）

ALL-CON

122 of 262

55.0

23.6

n.d.

n.d.

0.03times; (25 °C)

肯普消除酶|Q06121

5-硝基苯并恶唑

系统发育（CD）e

R2minus;4/3D

9 of 247

72.0

10.0

n.d.

n.d.

11.46times; (25 °C)

卤代烷脱卤酶|593

1-碘己烷

杂交

DhaA115

11 of 294

49.0

24.6

200times; (60 °C)

0.31times; (37 °C)

2.77times; (37 °C)

卤代醇脱卤酶|Q93D82

rac-p-硝基-2-溴-1-苯乙醇

杂交

HheC-H12

13 of 253

57.0

25.5

n.d.

n.d.

0.88times; (30 °C)

9

可溶性生物催化剂

酶| UniProt ID

基质

方法

突变码

变异

wild-type Tm [°C]

Delta;Tm [°C]b

expr. yieldc

specifific activityc

expr. host

ref

卤代烷脱卤酶| 593

1,2-二溴乙烷

系统发育（ASR）

AncHLD2

69 of 317

53.6

21.9

4.8times; (20 °C)

1.86times; (37 °C)

E. coli

46

alpha;-半乳糖苷酶| P06280

alpha;-D-半乳糖

杂交种

A348R/A368P/S405L

3 of 397

n.d.

n.d.

1.4times; (37 °C)

2.00times; (37 °C)

H. gartleri

18

乙酰胆碱酯酶| P22303

乙酰胆碱

杂交种

dAChE4

51 of 542

44.0

18.3

2000times; (20 °C)

0.89times; (25 °C)

E. coli

47

表2 稳定且可溶的生物催化剂的计算机设计方法的优缺点

方法 优点 缺点

能量计算 可以通过不同的力场来调整预测的粒度 精确方法的计算成本高

web服务器使没有经验的用户可以访问预测 对高分辨率结构的依赖

不断发展的结构数据库与同源性建模和分子穿线的进展 稳定性与活性之间的权衡

单点突变预测的高精度 预测的稳定突变体可能无法表达

机器学习 非常迅速的预测 缺乏均衡的高质量实验数据

易于实现和使用 当前模型的精度有限

特性的广泛适用 过度训练的风险

不需要理解所有的依赖关系

可以发现以前未知的模式

系统发生学 层序资料丰富 相关序列的选择是非平凡的

预测不需要的结构 需要对基因家族有深刻的了解

web服务器可用于某些任务 CD：不考虑上位性作用

CD:简单快捷 ASR:数据集大小较小，原因是计算成本

CD:若干 第一LTER可用于提高预测精度 ASR:需要技术技能和经验

ASR:高热稳定性变体的预测是可以实现的

ASR:不需要极端性蛋白质序列

ASR:保持序列上下文和上位性

CD，共识设计； ASR，原始序列重建

2.测定蛋白质稳定性和溶解度的实验框架

2.1蛋白质稳定性的实验测定

已知球状蛋白在一定程度上是稳定的，折叠状态和未折叠状态之间的自由能差（图1）低至5 kcal / mol。分析蛋白质稳定性的两个关键概

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