用于CO2转化的辅助因子再生的共固定化多酶纳米反应器外文翻译资料

 2022-08-08 15:14:11

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用于CO2转化的辅助因子再生的共固定化多酶纳米反应器

摘要

多酶转化二氧化碳(CO2)化学制品已被广泛研究过。然而，辅助因子的再生和再利用仍然是CO2有效转化的主要问题。在本研究中，通过将碳酸酐酶(CA)、甲酸脱氢酶(FateDH)、辅因子(NADH)和谷氨酸脱氢酶(GDH)同时包埋在ZIF-8中，构建纳米级多酶反应器。在多酶反应器中，阳离子聚电解质(聚乙烯亚胺，PEI)通过溶解在ZIF-8的前驱体中，然后掺杂到ZIF-8中。辅因子(NADH)通过PEI(正电荷)和辅因子(负电荷)之间的离子交换锚定在ZIF-8中，并通过嵌入在ZIF-8中的GDH再生，从而保持FateDH的高活性。FateDH在多酶反应器中的活性回收率达到50%。此外，CA和ZIF-8的结合显著增加了CO2在反应溶液中的溶解，结果表明，纳米级多酶反应器在CO2转化为甲酸盐方面具有优越的能力。与自由多酶体系相比，纳米多酶反应器的甲酸酯产率提高了4.6倍。此外，纳米级多酶反应器经过8次循环后仍保持原产量的50%，表明其具有良好的重复使用性。

关键词：二氧化碳 生物转化 辅因子再生 ZIF-8 多酶体系

1.简介

在全球变暖日益加剧的今天，捕获和转化二氧化碳(CO2)用于合成化学品已引起人们的广泛关注。在过去的十年中，各种各样的二氧化碳转化策略，如化学、生物和酶转化已经被开发出来。其中酶法转化因其产率高、选择性和特异性强、条件温和等优点而受到人们的高度重视。然而，游离酶在恶劣条件下往往表现出较低的稳定性和较差的活性。酶固定化技术是一种公认的提高酶稳定性的常用方法。一般来说，通过多点或多亚基固定化可以提高酶的稳定性，可以防止亚基解离、减少聚集、增强酶的硬化、抵抗抑制剂或化学物质等。近年来，多种酶级联反应有在工业水平上对许多化合物的生产具有重要作用，因为它们能进行非常复杂的反应。特别是CO2的多酶转化已显示出良好的应用前景。Obert和Dave首次证明了在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸存在下，甲酸脱氢酶(FDH)、甲醛脱氢酶(FaldDH)和醇脱氢酶(ADH)可以将CO2连续还原为二核苷酸(NADH)。随后，人们进行了大量的研究工作来实现多酶体系将CO2转化为甲醇。尽管CO2转化为化学品的多酶体系是令人惊叹的，但由于CO2在反应介质中的低溶解度，多酶体系表现出成本高、耗时长、产率低等缺点。同时，多酶体系中游离酶的稳定性差，回收困难，严重阻碍了其工业化应用。此外，辅助因子的再生和再循环常常是在工业水平上实施酶的一个障碍。

为克服这些问题，我们应用了多酶共固定化CO2转化策略。例如，FDH、FaldDH和ADH被成功地共固定在一些载体上，如微囊腔、平板聚合物膜、中空纳米纤维和硅质介孔结构泡沫(MCFs)。然而，CO2的转化效率仍然很低。此外，一旦不太稳定的酶失活，所有共固定化酶必须被丢弃，即使其中一些酶完全保持其活性。

一般而言，有效的共固定化策略应遵循以下原则：首先，固定化过程中应尽量减少酶的变性。其次，在共固定化系统中酶和底物之间的传质限制应该很低。第三，在共固定化系统中实现辅因子的再生是必须的。最后，提高CO2在反应溶液中的溶解度是提高CO2转化率的关键。在此基础上，构建了NADH再生CO2转化的多酶共固定化体系，提高了甲醇产率。此外，还使用离子溶液来增加CO2共固定化多酶级联反应的溶解度。尽管这些例子在提高共固定化多酶系统的催化效率、高效再生和辅助因子再利用方面显示出巨大的潜力，提高CO2在水介质中的溶解度仍然是CO2固定化多酶体系的最大挑战。近年来，金属有机骨架材料已成为酶固定化的有效载体。与其他多孔材料相比，MOFs在保持酶活性和稳定性方面表现出优越的性能。此外，最近的报道表明，一些MOFs(如ZIF-8)具有很高的CO2捕获能力。此外，碳酸酐酶(CA, EC 4.2.1.1)是一种具有相同三级折叠的含锌酶，具有催化二氧化碳的可逆水合作用，加速CO2的水合作用。因此，通过将CA固定在ZIF-8中，使CA与ZIF-8结合，可以显著提高CO2在水溶液中的溶解度。聚乙烯亚胺(PEI，一种阳离子聚电解质)是一种含有伯氨基、仲氨基和叔氨基的聚合物，具有较强的阴离子交换能力，能够与酶或载体上的不同基团发生化学反应。此外，使用PEI共固定化酶和辅助因子是设计酶复合催化剂用于级联反应的首选方法之一。

在本研究中，我们提出了两种用于ZIF-8多酶催化的固定化策略，称为共固定化和混合固定化，如图1所示。对于共固定化多酶反应器(Co-IMR)，CA、谷氨酸脱氢酶(GDH)、FateDH(催化甲酸盐可逆转化为二氧化碳的金属酶)、辅助因子(NADH)和PEI通过共沉淀法原位共包埋在ZIF-8中。在Co-IMR中，辅因子(NADH)通过PEI(正电荷)和辅因子(负电荷)之间的离子交换锚定在ZIF-8中，并通过嵌入在ZIF-8中的GDH再生。ZIF-8中的CA加速了CO2的水化，FateDH将CO2转化为甲酸盐(图1a)。

图1 Co-IMR和Mix-IMR的制备

对于混合固定化多酶反应器(Mix-IMR)，一方面，通过共沉淀法将CA和FateDH共包埋在ZIF-8中，获得生物催化剂(酶@ZIF-8)。另一方面，PEI、NADH和GDH嵌入到另一个ZIF-8中,形成NADH再生系统(NADH@ZIF-8)。在催化过程中，将酶@ZIF-8和NADH@ZIF-8混合，实现CO2转化为甲酸盐(图1b)。为了比较，分别构建了不含PEI的Co-IMR、不含GDH的Co-IMR和游离多酶体系(包括CA、FateDH、GDH和NADH)。据我们所知，这是首次在ZIF-8中构建具有共因子再生的共固定化纳米多酶反应器。此外，还探讨了共固定化多酶催化CO2转化为甲酸盐的反应机理。

2.材料和方法

2.1.材料

来自Candida boidinii甲酸脱氢酶(FateDH, EC.1.2.1.2)，对硝基苯乙酸酯(p-NPA)，对硝基苯酚，硝酸锌六水合物(Zn(NO3)2·6H2O)、碳酸酐酶(CA, EC.4.2.1.1)、2-甲基咪唑、l -谷氨酸购自Sigma-Aldrich化学有限公司。谷氨酸脱氢酶(GDH, EC.1.4.1.2)购自罗氏诊断公司。异硫氰酸荧光素(FITC)， 硫罗丹明101, Cy5.5-NHS，聚乙烯亚胺(PEI, MW = 70000 g/mol, Cat#E8420)， NADH，和NAD 购自北京索拉比奥科技有限公司,NAD/NADH定量试剂盒购自苏州科明生物科技有限公司(NAD-2-Y)。甲酸盐(色谱级，批号F1817047)购自阿拉丁工业公司。本研究中使用的其他化学物质都是分析级的。

2.2.共固定化多酶反应器的制备

将200 mu;L甘油和800 mu;L 0.2 M磷酸缓冲液(pH 7.0)混合，其中CA 5 mg, Fate DH 15 mg, PEI 15 mg, NADH 15 mg, GDH 15 mg。随后，在上述混合溶液中加入1 mL (0.4 M)硝酸锌溶液，搅拌。最后，向混合物中添加10 mL 2-甲基咪唑溶液（1 M），并在室温下搅拌30 min。白色沉淀物以12000times;g离心5min回收，用Milli-Q水洗涤3次，4℃保存备用。

2.3.混合固定化多酶反应器(Mix-IMR)的制备

对于Mix-IMR，一方面混合200mu;L甘油、800mu;L含5 mg CA和15 mg Fate DH的磷酸盐缓冲液(0.2M，pH7.0)和1mL硝酸锌溶液(0.4M)。再加入10 mL 2-甲基咪唑溶液(1 M)，形成酶@ZIF-8。另一方面，将含有15 mg PEI、15 mg NADH和15 mg GDH的200mu;L甘油、800mu;L磷酸盐缓冲溶液（0.2 M，pH 7.0）与1 mL硝酸锌溶液（0.4 M）混合，并将10 mL 2-甲基咪唑溶液（1 M）添加到混合物中以获得NADH@ZIF-8。酶@ZIF-8和NADH@ZIF-8离心回收，用Milli-Q洗涤三次，晾干。最后，将酶@ZIF-8和NADH@ZIF-8按1:1 (m/m)混合，得到混合IMR。为了进行比较，分别制备游离多酶体系(包括CA、FateDH、NADH和GDH)、不含GDH的Co-IMR和不含PEI的Co-IMR。

2.4.NADH保留率和活性测定

研究PEI浓度(0 ~ 20 mg/L)对NADH保留效率的影响，以获得最大的NADH保留效率。将制备好的NADH@ZIF-8浸泡在5 mL 0.2 M的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)中，室温150 rpm振荡孵育30分钟。使用NAD/NADH定量试剂盒测定ZIF-8释放到缓冲溶液中的NADH浓度。NADH保留效率表示为ZIF-8中保留的NADH与溶液中初始添加NADH总量的比值。

另外，通过测定对硝基苯酚在室温下的初始水解速率，测定游离钙和固定化钙的活性。简单地说，将含有p-NPA (3 mu;mol/L)和游离CA (3 mu;g/mL)的PBS (10 mM, pH = 7.4)或含有CA(约3 mu;g)的共固定化多酶纳米反应器(约1 mg)混合反应3min，通过测定348 nm处的吸光度来监测总反应过程。CA活性定义为每分钟p-NPA的水解度。与CA相似，通过测定相应甲酸的初始还原速率来测定Fate DH活性。通过测定340 nm处的吸光度来监测反应过程。甲酸脱氢酶活性定义为减少1 mu;mol甲酸所需的酶量。此外，还需计算共固定化多酶纳米反应器中CA和Fate DH的回收活性。固定化多酶纳米反应器的计算如式(2)

2.5.方法描述

采用扫描电子显微镜(SEM, Hitachi S4800)观察ZIF-8的形貌。在400–4000 cmminus;1范围内进行FT-IR测量(Nexus870红外光谱仪)。用x射线粉末衍射仪(D/Max-2500衍射仪，日本岛津)记录了粉末x射线衍射(PXRD)图谱。采用能量色散光谱仪(S2 Ranger, Bruker, Germany)测定Co-IMR的元素组成。为了表现酶在ZIF-8中的分布，分别用异硫氰酸荧光(FITC)、硫罗丹明101和Cy 5.5-NHS染料标记CA、Fate DH和GDH。用标记的CA、FateDH和GDH制备Co-IMR。共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)采用德国徕卡TCS SP5显微镜(Leica Camera AG, Germany)。激光在488、543和673nm处激发FITC和硫罗丹明101以及cy5.5-NHS，并在545、605和707nm处检测到发射荧光。

2.6.温度和pH对固定化酶和游离酶的影响

温度对游离CA和Fate DH的影响,通过添加酶对固定化CA和FateDH进行研究，在不同温度下将样品放入基质溶液中（20–60℃）30分钟。pH对游离CA和Fate-DH、固定化CA和Fate DH活性的影响也通过将酶样品加入30℃下不同pH（4–10）的底物溶液中30分钟来测定。CA和Fate-DH的活性测定如活性测定部分所述。

2.7.二氧化碳转化为甲酸盐

对于共固定化多酶，将CO2气体引入含有10 mM L-谷氨酸盐的PBS（10 mM，pH=7.4）中30 min。再加入50mg共固定化多酶（0.8u/mg Fate DH，1.6u/mg CA，22u/mg GDH，40mg/mg）反应1h。对于游离多酶体系，将CO2气体引入含有10 mM L-谷氨酸和游离酶（包括4 U Fate DH、80 U CA和120 U GDH）的反应混合物中30 min，然后加入NADH(2 g)引发反应。1 h后，从反应混合液中提取含甲酸的样品20 mu;L，采用BIO-RAD有机酸分析柱(HPX-87H离子排斥柱，300 times; 7.8 mm)和210 nm紫外检测器进行高效液相色谱(HPLC)检测。流动相为5 mM H2SO4，流速为0.6 mL/min。分析期间柱温保持在65°C。利用已知的甲酸浓度范围为10 ~ 200 mu;g/mL，建立了甲酸的校准曲线。

2.8.可行性测试

通过测定Co-IMR在重复使用过程中的甲酸产率来评价其可重复使用性。将CO2气体引入含有10 mM L-谷氨酸盐和50 mg Co IMR的混合溶液中1 h，然后过滤回收反应混合物中的Co-IMR，洗涤3次，然后用新的反应溶液悬浮。从8个循环中收集反应溶液。采用高效液相色谱法测定甲酸酯产率。

3.结果与讨论

3.1.纳米级多酶反应器的制备与特征

先前的报道表明，在ZIF-8中共沉淀可以原位包裹酶。固定酶周围形成的ZIF-8保护壳可以防止酶分子从ZIF-8中泄漏。酶辅因子在辅因子依赖性酶中起主要作用。然而，辅助因子的回收常常是在工业水平上实施酶的一个障碍。因此，需要制备将辅因子和酶共固定在同一材料上的生物催化剂，才能在不外加辅因子的情况下进行化学反应。近年来，人们

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