减少奥奈达希瓦氏菌MR-1在微生物反硝化过程中亚硝酸盐积累和N2O排放提高反硝化性能外文翻译资料

 2022-08-08 15:33:24

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减少奥奈达希瓦氏菌MR-1在微生物反硝化过程中亚硝酸盐积累和N2O排放提高反硝化性能

摘要

据报道，生物脱氮（即微生物将硝酸盐还原成气态氮）通常受到操作和环境参数的影响，如碳源类型、pH值和温度。本文研究了奥奈达希瓦氏菌MR-1去除亚硝酸盐积累和一氧化二氮排放从而提高反硝化性能的机理。研究发现，奥奈达希瓦氏菌MR-1本身具有很低的硝酸盐去除能力，但它存在于一种经过充分研究的脱氮菌（副钩菌deni-trifilcans）的脱氮系统中，明显提高了硝酸盐去除效率（从65.3%提高到97.8%)，减少了亚硝酸盐积累（从0.67到无法检测）和N2O生成（从8.87mm/mm-tN到无法检测）。作用机理研究表明，奥奈达希瓦氏菌MR-1促进了电子转移活性，通过细胞间形成纳米管，导致反硝化酶的活性、碳源代谢、ATP水平和细胞活力的增加。由于奥奈达希瓦氏菌MR-1增强了电子的产生、转移和吸收,从而提高了反硝化性能,减少了亚硝酸盐的积累和N2O的排放。最后，通过实验室地下水处理实验验证了奥奈达希瓦氏菌MR-1增强的反硝化性能。本研究提示了奥奈达希瓦氏菌MR-1在加速硝酸盐在地球化学氮循环中的生物转化和促进硝酸盐污染生物处理方面具有潜在的作用，其有害中间体(亚硝酸盐和N2O)积累可忽略不计。

关键词：脱氮；亚硝酸；希瓦氏菌；N2O ；NADH；电子

1.导言

21世纪初，人类活动不断向生物圈输入活性氮，到本世纪末，氮的聚集量将达到600 Tg N yr-1、特别是通过燃烧排放、氮肥的使用以及生物和农业固氮(Burow 等人.， 2010;Fowler等人，2015年)。据报道，如果过量的氮以氮气的形式进入大气，全球氮循环将会崩溃(Dalsgaard等人.， 2003)。硝酸盐特别容易通过水和土壤流动，来自污水、农业肥料或集约化耕作的过量硝酸盐很容易进入地下含水层和地表水。它是一种必要的营养物质，但其在水生生态系统中的过度输入会造成环境污染和安全问题，这已受到研究人员的广泛关注(Ballantine等人.， 2014)。

生物反硝化在生物圈氮循环中起着重要作用。微生物反硝化具有操作方便、二次污染小等优点，已广泛应用于减少或去除地下水等污染环境中的硝酸盐。据报道，生物脱硝受到环境和操作参数的影响，如碳源、pH值和温度(Lu 等人， 2014)。城市污水生物脱氮和地下水,最大的挑战是碳的低生物利用率造成的低脱氮效率，即使水中含有的有机物被分解解,很难实现生物脱氮所需的碳氮比(BOD5 / TKN gt; 5)((Gu 和 Onnis-Hayden, 2010; Huno等人., 2018; Rivett 等人, 2008).)。此外，生物反硝化过程中容易产生有毒的一氧化二氮(N2O) (Itokawa 等人.， 2001)。因此，人们一直在努力提高硝酸盐的生物转化。例如，通过补充外部碳源，如甲醇、乙醇或乙酸，可以显著提高反硝化性能(Salminen等人.， 2014;史密斯等人，2001年)。然而，它增加了工艺成本，而且不准确的碳源剂量会导致二次污染(Ballantine等人， 2014)。

生物反硝化需要电子的参与，将硝酸盐连续还原为亚硝酸盐、一氧化氮、氧化亚氮，最后是氮气。为了达到这个目标,异养反硝化细菌代谢碳源产生直接电子供体,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),然后通过电子传递系统传输(例如,NADH脱氢酶(复合物I),醌池,群体bc1复合物(复合物III)和细胞色素c转化到相应的反硝化还原酶(博克斯等人., 1995)。因此，增加电子的产生、传输和消耗将促进反硝化过程中涉及的一系列生化反应。然而，利用非化学方法同时增加电子的产生、传输和消耗来提高反硝化性能，同时减少微生物反硝化过程中亚硝酸盐的积累和N2O的排放，迄今尚未见文献报道。奥奈达希瓦氏菌MR-1在不同的生态位被报道，如奥内达湖、黑海、温泉和哥伦比亚河(Ghoshl.等人， 2003;Turse等人，2010;Venkateswaran等人，1999年)，并作为一种在环境生物修复方面很有前途的微生物被频繁研究(Min等人，2017;Szczuka等人，2015年)。本文研究了奥奈达希瓦氏菌MR-1通过降低亚硝酸盐积累和N2O排放来提高反硝化性能，并对其机理进行了进一步探讨。首先，比较了一种常用的反硝化菌(副钩藻)在存在和不存在奥奈达希瓦氏菌MR-1时的反硝化性能。作为它的补充，奥奈达希瓦氏菌MR-1增强了脱氮的性能,单独培养的奥奈达希瓦氏菌MR-1显示了少量的硝酸盐去除，这是奥奈达希瓦氏菌MR-1的反硝化机理。通过对碳源的研究对该体系的代谢,NADH生产、电子传递和酶促脱氮所涉及的反应进行了研究。最后，在试验室地下水生物处理系统中评价了利用奥奈达希瓦氏菌MR-1增强反硝化性能的可行性，为今后的实际应用提供参考。

2.材料和方法

2.1微生物的来源

P.反硝化菌(ATCC, 19367)是文献中广泛使用的一种反硝化菌(图S1，辅助信息)，本研究采用它作为反硝化菌的模型。使用前将奥奈达希瓦氏菌MR-1(ATCC 700550)和P.反硝化菌(ATCC, 19367)在80℃温度下保存。用浴振器(150 rpm)在30℃下通氧培养，直到对数生长期后期。然后通过离心(4500 rpm, 5min)收集细胞，用0.1 M PBS (pH 7.4)洗涤两次，使用前重悬于PBS中。同济大学校园(上海四平路1239号，200092)地基土提取深度为2 m。用PE密封袋密封后立即运至实验室。土壤经2mm筛网过筛并均匀化后作为地下水反硝化实验样本。

2.2 脱氮介质

在脱氮器模型的脱氮实验中,基本的培养基是我们先前描述的改良版本,包含21.36 mM KNO3, 10.66 mM NH4Cl, 17.93 mM KH2PO4, 32.76 mM Na2HPO4, 0.41 mM MgSO4*7H2O, 5 mL 微量金属和 10 mL维生素溶液(Cruz-Garcia et al ., 2007;Wan等人，2016)。根据我们之前的结果，添加量为43.17 mM CH3COONa用于生物量增长和硝酸盐还原。由于乙酸盐不是奥奈达希瓦氏菌MR-1的首选碳源，除非有特别指示，否则将少量L -乳酸盐(3.00 mM)默认添加到该菌株接种的瓶中(Gao等，2009)。用2.0 M HCl和2.0 M NaOH调节初始培养基pH至7.2。在无氧条件下，将培养基用无氧N2(15分钟)广泛清洗到160毫升的玻璃血清瓶中，然后用黑色的丁基塞密封，在121摄氏度下高压灭菌（0.12MPa作用十五分钟）。为了防止沉淀的形成，将MgSO4*7H2O、微量金属和维生素分别高压灭菌200倍的原液，然后用注射器加入血清瓶中，培养基的总容积为100毫升。

在地下水脱氮实验中，主要离子，由最新的《上海地质环境公报》(http://www.shgtj.gov.cn/dzkc/dzhjbg/201412/t20141215_642773)报道。根据其在地下水采样点中测量的平均浓度(表S1，辅助信息)，分别为1.55 mM NaCl、1.75 mM MgCl2$6H2O、2.38 mM Ca(HCO3)2、2.60 mM NaHCO3、0.02 mM NH4Cl、0.51 mM NO3 -N和0.009 mM KNO2。地下水硝酸盐的浓度在实际环境中也有变化,为了维持一个稳定的初始硝酸盐浓度,在所有实验中都添加了KNO3，以达到3.50mM NO3-N的最终浓度，根据以前的报告用以监测地下水中较高的硝酸盐污染(王et al ., 2009)。添加10.00 mM CH3COONa和1.00 mM L-乳酸盐为碳源进行地下水反硝化实验。

2.3 奥氏芽孢杆菌MR-1对模型反硝化菌性能影响的实验研究

在实验前，通过研究P.反硝化细菌与奥奈达希瓦氏菌MR-1比 的OD600的值不同接种率对反应器中硝酸盐去除效率的影响，确定了在模型反硝化剂中奥尼氏菌MR-1的添加量。接种的反硝化单胞菌的OD600保持在0.02，但根据研究的P/ S比例改变了 奥奈达希瓦氏菌MR-1的OD600。我们发现，随着奥奈达希瓦氏菌MR-1添加量的增加，硝酸盐的去除效率提高(图S2，支持信息)。本研究仅以一个P/S比值(即1/5)为例，研究了奥奈达希瓦氏菌MR-1对模型反硝化菌性能及机理的影响。

实验过程如下。使用9个厌氧瓶，每个厌氧瓶加入100 mL反硝化培养基。将这些瓶子平均分为三组(M-1、M-2、M-3)，见表1。在M-1和M-2瓶中分别接种od600为0.02和od600为0.10的反硝化菌，在M-2和M-3瓶中分别接种奥奈达希瓦氏菌MR-1。然后用0.1 M PBS调整每瓶液体介质的总容积为110 ml。所有瓶子在30plusmn;1℃的空气浴振荡器(150 rpm)中保持不变。样品在不同的时间用注射器抽取，并在湿分析前通过0.22 mm膜过滤器过滤。

2.4对反硝化菌利用乙酸盐的影响

在本研究中，存在两种不同的微生物，即反硝化P.反硝化菌(P.反硝化P.反硝化菌)和 奥奈达希瓦氏菌MR-1，其碳源分别为乙酸盐和乳酸盐。尽管乳酸盐的含量远低于乙酸盐，而且单培养的奥尼根菌MR-1本身对反硝化作用也有一定的贡献，但它们对反硝化菌利用乙酸盐的作用尚需进一步研究。此外，还研究了乙酸盐和反硝化菌的存在对奥尼虫MR-1利用乳酸盐的影响。分批试验在15个厌氧瓶中进行，平均分为5组(C-1、C-2、C-3、C-4和C-5)，除碳源和接种器外，其他细节与2.3节中所述相同(见表1)。

表1

间歇试验中碳源和种子微生物的试验设计。

m-1

m-2

m-3

C-1

C-2

C-3

C-4

C-5

R-1

R-2

乙酸酯（毫米）

43.17

43.17

43.17

43.17

43.17

43.17

43.17

43.17

10.00

10.00

L-乳酸(mM)-A3.00E3.00E3.001.00 3.00 3.00 1.00

奥奈达希瓦氏菌MR-1(OD600)

e

0.10

0.10

e

0.10

e

0.10

0.10 0.2 0.2

P.脱硝剂(OD600)

0.02

0.02

e

0.02

0.02

0.02

e

E*B*

a无增列。

b添加5.0克/升地面土壤而不是反硝化假单胞菌。

2.5 奥奈达希瓦氏菌MR-1对地下水反硝化作用的影响试验

使用6个厌氧瓶，每个厌氧瓶中加入300毫升合成地下水。将这些瓶子平均分为R-1和R-2两组，R-1不添加奥奈达希瓦氏菌MR-1作为对照。在R-2中向每一瓶添加奥奈达希瓦氏菌MR-1，最终od600为0.2。为了模拟实际的地下水环境，将土壤分别播种浓度为5.0 g/L的R-1和R-2(见表1)。在用氮气冲洗15分钟以除去氧气后，所有瓶子用橡胶塞盖上，密封并置于30plusmn;1?C的空气浴振荡器(80 rpm)中。样品在不同的时间提取，然后液体样品通过0.22 mm膜过滤器过滤，然后分析。

2.6 络合物I、络合物III和电子传递系统活性测定(ETSA)

收集实验结束后的细胞，用0.1 M PBS (pH 7.4)洗涤两次，然后重悬于PBS中，制备细胞粗提物用于复合物I和复合物III的测定。超声20khz, 5min, 4℃;离心10min, 14000 g, 4℃。配合物I的活性是通过在340 nm处测量NADH的减少来估计的。反应混合物(1ml)含有100mM NADH、50mM泛素酮(Aladdin, China)和300mL细胞提取物(Humphries and Szweda, 1998)。此外，添加5mM azoxystrobin(中国Aladdin)以消除复合物III对NADH的消耗(Esser et al.， 2004)。配合物III的活性通过监测细胞色素c在550 nm处的降低来测定。反应混合物(1 mL)含有0.5 mM-EDTA、50mM氧化细胞色素c、40mm泛素-2和300mL细胞提取物(Veitch et al.，

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