优化苏云金芽孢杆菌EC1发酵条件，提高蛋氨酸产量外文翻译资料

 2022-08-15 14:51:38

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优化苏云金芽孢杆菌EC1发酵条件，提高蛋氨酸产量

摘 要

从豆豉种子中分离得到苏云金芽孢杆菌EC1产生的蛋氨酸产量为1.89mg/ml。苏云金芽孢杆菌EC1的培养条件对蛋氨酸积累的影响表明，培养基/发酵剂的体积比为20％，接种量为5％时，蛋氨酸的产量增加。碳源麦芽糖，在8％的水平刺激了蛋氨酸的生产。在研究的氮源中，发现硫酸铵是最好的，在1%浓度下产生2.56mg/ml的蛋氨酸。所有促进生长的物质及其混合物均增强了苏云金芽孢杆菌EC1的蛋氨酸积累。维生素对蛋氨酸生产的影响表明，核黄素和盐酸硫胺素浓度为1.0micro;g/ml时分别产生2.49mg/ml和2.80mg/ml蛋氨酸。二价金属对蛋氨酸积累的影响表明，在所有浓度下，Zn2 都会刺激蛋氨酸的产生。Mg2 和Ba2 浓度在0.1micro;g/ml和10.0micro;g/ml都可以提高蛋氨酸的产量。优化苏云金芽孢杆菌EC1在水下培养基中的培养条件，得到的蛋氨酸产量为3.18mg/ml。

关键字 芽孢杆菌，蛋氨酸，优化，浸没培养基，麦芽糖

1.介绍

蛋氨酸是必需氨基酸，最早是由Mueller分离的[1]。蛋氨酸在坚果、肉类和其他一些植物食品中含量很高。但是，在人类和动物体内，这种氨基酸是不能产生的，因此是一种重要的营养添加剂。已经研究了L-蛋氨酸对动物营养的影响以及其缺乏作为营养饲料添加剂的后果。对于家禽，观察到蛋壳的稳定性下降，就像奶牛的产奶一样[2]。

目前，蛋氨酸是通过化学合成或水解蛋白质生产的。这些过程很昂贵。化学合成产生D-和L-蛋氨酸的混合物[3]，而蛋白质的水解导致形成复杂的混合物，必须从中分离蛋氨酸。具有生物活性的L-蛋氨酸可以通过酶促合成（前体的生物转化）或使用微生物的深层发酵来生产[3]。由于发酵过程已经能够廉价地提供许多其他氨基酸，因此人们对开发用于蛋氨酸商业化生产的微生物过程非常感兴趣[4] [5]。

已经分离出许多能够产生氨基酸的微生物，并且通过发酵成功地产生了氨基酸，例如赖氨酸，苏氨酸， 异亮氨酸和组氨酸[6] [7]。人们已经尝试通过发酵过量生产具有生物活性的L-蛋氨酸[8]-[10]。

本研究旨在探讨文化条件对苏云金芽孢杆菌EC1蛋氨酸积累的影响。

2.材料和方法

2.1微生物

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) EC1，是从豆豉种子中分离得到的大五重木霉(Pentachletra macrophila Benthan)并根据韩国Macropen Incop的16S rRNA序列进行了鉴定。在4℃下，用营养琼脂(Lab M)斜面保存。

浸没培养基发酵

发酵按照Ozulu等人描述的方法进行[11]。将一环24小时培养的苏云金芽孢杆菌ec1接种于1ml无菌种子培养基(蛋白胨，10.0 g;酵母提取物,10.0克;氯化钠,5.0克;水,1 L;pH 7.2)置于试管中，30°C置于VWR DS2-500-2轨道摇床上，160转/分，孵育24小时。

一个100毫升的锥形瓶，其中装有20毫升的无菌发酵培养基{KH2PO4，0.05克；K2HPO4，0.05克;MgSO4·7H2O, 0.1g;MnSO4·4H2O, 0.001g;FeSO4·7H2O,0.001 g;碳酸钙3，20.0 g;（基础培养基），葡萄糖，20.0g，（NH）SO，10.0g;HO，1升；;pH 7.2接种种子培养基1ml(约3.15times;106细胞/ml)。一式两份制备的烧瓶在30℃摇床(160转/分)上孵育，72h后进行肉汤培养，测定蛋氨酸积累。未接种的烧瓶作为对照。

蛋氨酸测定

按照Greenstein和Wintz [12]所述的方法测定蛋氨酸的含量。将肉汤培养物以1500times;g离心15 min，取试管上清液5ml，加入5n NaOH 1ml和10%硝普钠溶液0.1 ml。将试管彻底摇匀，静置10分钟，然后加入2 ml 3%的甘氨酸水溶液，反复摇匀反应10min再间隔10分钟后，将2毫升浓缩的磷酸滴入混合物中，适当地摇动试管。使显色进行5分钟，并在分光光度计（PerkinElmer Lambda 35 UVVIS）中在540nm下测量颜色强度。从标准蛋氨酸曲线推断出蛋氨酸的产量。

2.2蛋氨酸生产发酵条件的优化

2.2.1培养基/发酵罐体积比和接种量对蛋氨酸产量的影响

研究了培养基/发酵剂的体积比（培养基的体积：发酵瓶的体积）和接种量对苏云金芽孢杆菌EC1产生蛋氨酸的影响。将具有不同体积（20、25、30 ml）无菌发酵培养基在锥形瓶（100 ml）分别接种1 ml 种子接种物。每1 ml含有一环（约3.15times;106细胞/ ml）或两环（约7.56times;108细胞/ ml）。如前所述温育烧瓶并测定蛋氨酸的积累。

2.2.2碳源的影响

研究了不同碳源（葡萄糖，麦芽糖，甘露醇，蔗糖，乳糖）对苏云金芽孢杆菌EC1中的硫氨酸积累。向100 ml的锥形瓶中接种1 ml的24小时种子培养液，其中装有20 ml的基础培养基，碳源20.0 g（NH4）2SO410.0 g，pH 7.2接种物的发酵过程和蛋氨酸测定如前所述。蛋氨酸产量最高的碳源用于进一步研究。

还研究了不同浓度（20、40、60、80、100 g / l）麦芽糖的影响。

2.2.3氮源的作用

研究了不同氮源（硫酸铵，氯化铵和尿素）对蛋氨酸生产的影响。向100 ml的锥形瓶中接种1 ml的24小时种子培养液其中装有20 ml的基础培养基，20.0 g的麦芽糖，10.0 g的氮源，pH 7.2。如前所述进行发酵，并从肉汤培养物中确定蛋氨酸的积累。蛋氨酸产量最高的氮源用于进一步研究。

还研究了不同浓度（10、20、40、60、80 g / l）硫酸铵的影响。

2.2.4生长刺激剂的作用

研究了0.1％（w / v）酵母提取物，蛋白冻，酪蛋白及其混合物对苏云金芽孢杆菌EC1蛋氨酸产量的影响。如前所述测定蛋氨酸。

2.2.5维生素的影响

不同浓度(0.10,1.0,5.0,10.0micro;g /ml)吡哆醇、烟酸和盐酸硫胺素对云金芽孢杆菌产生蛋氨酸的影响。

2.2.6二价金属的影响

发酵过程的影响进行了探讨不同浓度(0.10,1.0,5.0,10.0micro;g /ml) 的氯化钙,氯化锌，氯化钡对苏云金芽胞杆菌肉汤中蛋氨酸积累的影响

2.2.7生长，pH，糖利用率蛋氨酸生产的时程实验

研究了苏云金芽孢杆菌EC1的生长、pH值、糖利用和蛋氨酸生产的时程试验。发酵培养基由基础培养基、麦芽糖、80克;(NH4) 2 so4、10 g;酵母提取物，0.05% (w/v);蛋白胨,0.05% (w / v);核黄素1.0micro;g /毫升; MgO, 0.10 micro;g/ml水1 L;pH值7.2。如前所述进行发酵过程，并用660 nm分光光度计进行浊度测定。前所述确定肉汤培养物中蛋氨酸的浓度，并按照Miller [13]所述的方法估算糖的利用率。

讨论和结果

从发酵食品中分离的蛋氨酸生产商苏云金芽孢杆菌EC1被发现在水下培养基中积累了1.89 mg / ml的蛋氨酸。分离作为蛋氨酸生产者的芽孢杆菌属生物与其他研究者的工作一致[14]。然而，作为棒状杆菌、短杆菌和节杆菌的物种，芽孢杆菌还不知道是非常活跃的生产者[8] [15]。

代谢产物的微生物生产中需要足够的通气[16]。有关氧张力的结果（图1）表明，当液体体积增加到20ml以上时，蛋氨酸的产量会下降。因此，20%是苏云金芽孢杆菌EC1沉液培养中蛋氨酸积累的最佳培养基/发酵罐容积比。这一发现得到了Pham等人[4]的支持。

发酵过程中接种物的大小会影响代谢物的产生[10] [17]。如图1所示。苏云金芽孢杆菌EC1接种量为5％ 可提高蛋氨酸的产量。高接种量会导致过多的生物量并耗尽产品形成[18]，还会减少溶解氧，并增加对 营养物的竞争[19]。极小的接种量可能导致生物量不足和代谢物形成减少[17]。因此，在合适的接种量 下，养分和氧气水平可支持生物体的充分生长，从而提高代谢产物的产生[17]。

碳源对蛋氨酸生产的影响表明，麦芽糖是首选碳源。在8%的水平上，可以得到2.49 mg/ml的高蛋氨酸产量(图2)。麦芽糖浓度与蛋氨酸浓度之间存在显著的正相关关系(r = 0.896, P = 0.039)，因此随着麦芽糖浓度的增加，蛋氨酸产量也随之增加。这与Banik和Majumdar[20]的研究结果一致，他们也报告了麦芽糖是生产蛋氨酸的最佳碳源。Camila等人的[21]也观察到芽孢杆菌在以麦芽糖为碳源的培养基中，胞外蛋白酶的产量有所提高。

对蛋氨酸生产的影响表明，硫酸铵的蛋氨酸产量最高。经统计分析，两者呈显著负相关(r = -0.965, P= 0.008)硫酸铵浓度与蛋氨酸浓度之间，随着硫酸铵浓度的增加，蛋氨酸产量下降，反之亦然。Pham等人认为，这可能是由于硫酸铵中的硫含量。由于蛋氨酸是一种含硫的氨基酸，预计在向培养基中提供单质硫时可以进行更多的合成。Kase和Nakayama [8]，Anike和Okafor [22] 报道了甲硫氨酸生产中使用硫酸铵。Pham等人[4]报告说，蛋氨酸的产生是氮浓度的函数。如图2所示， 蛋氨酸的产生随着硫酸铵浓度的增加而降低。正如Pham等人所建议的那样。可能归因于高氮浓度施加的渗透压，这对苏云金芽孢杆菌EC1的生长和蛋氨酸的积累有不利影响。在1％的硫酸铵浓度下观察到最大的蛋氨酸产量（图2）。

所有生长促进物质及其混合物均提高了苏云金芽孢杆菌EC1的蛋氨酸产量（图3）。这些生长促进剂或其混合物的刺激作用已被许多研究人员报道。Carlos和Meirre [23]通过芽孢杆菌属获得了最大的热稳定淀粉酶产量。与酵母提取物和蛋白胨的混合物。辣木等[24]，注意到假单胞菌属物种甲硫氨酸产量的增加。FMS18，其中将酵母提取物添加到培养基中。Phadatare等[25]报道了在存在酵母提取物， 蛋白胨和胰蛋白胨的情况下，分生孢子中的蛋白酶产生增强。Ekwealor和Obeta [26]观察到， 在巨大芽孢杆菌的培养液中添加酪蛋白可以改善赖氨酸的产生。

维生素对苏云金芽胞杆菌EC1蛋氨酸积累的影响（图4）表明，核黄素和硫胺素HCl浓度为1.0 micro;g / ml 可以提高蛋氨酸的产量。与蛋氨酸生产有关，不同浓度的维生素存在显着差异（F = 4.522（ANOVA）， P = 0.024）。在这项研究中观察到的蛋氨酸产量的增加与其他工人的发现是一致的。Tani[27]报道了在甲基营养型酵母念珠菌中向发酵培养基中添加200 micro;g / l硫胺素时，蛋氨酸的产量很高。森和查特吉[28]指出，盐酸硫胺刺激了各种微球菌2fa中赖氨酸的积累，wealor和Obeta [29]报告说，分别添加10 micro;g / ml和100 micro;g / ml的叶酸和核黄素后， 巨大芽孢杆菌SP 86和巨大芽孢杆菌SP 76的赖氨酸产量提高。

金属离子在发酵过程中起着重要的作用。它们中的大多数充当各种酶的辅助因子，或者可能充当代谢物合成步骤中涉及的酶的激活剂[3] [30]。二价金属对苏云金芽孢杆菌EC1产生甲硫氨酸的影响（图5）表明Zn2 ， Ba2 和Mg2 提高了甲硫氨酸的产量。在所有浓度的Zn2 刺激蛋氨酸的生产。Ekwealor和Obeta[29]的研究支持了这一结果，他们报道了在添加Zn2 的巨大芽孢杆菌的肉汤培养物中赖氨酸产生的改善。Sigel[31]也报道了锌离子在合成具有工业和医学意义的微生物次生代谢产物中的作用。0.1micro;g/ml的Mg2 使蛋氨酸的ac-增加苏云金芽孢杆菌EC1的累积量（图5）。El-Sayed [32]的发现支持了本研究中观察到的Mg2 的刺激作用， 他报道了当将镁离子添加到发酵培养基中时，黄曲霉会增加L-蛋氨酸酶的活性。同样，Saxena和Singh [33]观察到，使用芽孢杆菌属的固态发酵农用工业废料，镁离子可提高淀粉酶的产量。

苏云金芽孢杆菌EC1以10 micro;g / ml的Ba2 改善了蛋氨酸的积累（图5），表明这种金属离子在蛋氨酸生产中起着重要作用。

苏云金芽孢杆菌的生长，pH，糖利用率蛋氨酸积累的时程实验（图6）显示，在pH值为6.9的情况下， 在120 h后最大蛋氨酸产量为3.18 mg·ml，残留糖为39％。糖消耗与蛋氨酸产量之间的关系（图6）与Murgov和Zaitseva [34]在黄短杆菌178的赖氨酸生产研究中所观察到的相似。Ekwea-lor和Obeta [26] 在他们的工作中也获得了相似的关系。巨大芽孢杆菌对赖氨酸的积累。

四．结论

观察到含有麦芽糖，硫酸铵，酵母提取物，蛋白one，核黄素和氧化镁的发酵罐体积比为20％，可增加苏云金芽孢杆菌EC1的蛋氨酸积累。因此，该

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