新型冠状病毒受体结合的结构分析外文翻译资料

 2022-08-15 15:12:51

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新型冠状病毒受体结合的结构分析

摘要

新型冠状病毒是一种与SARS-CoV高度相似的新型冠状病毒。我们对冠状病毒进入宿主细胞的穗糖蛋白的受体结合域(RBD)进行了结构分析。这两种病毒的RBDs在氨基酸序列中有72%的同源性，分子模拟显示了高度相似的三元结构。然而，2019-nCoV有一个明显的环路，在SARS-CoV中，灵活的甘氨酸残基取代了刚性的脯氨酸残基。分子模拟显示，2019-nCoV RBD与血管紧张素转换酶2 (ACE2)的相互作用更强。柔性环中独特的苯丙氨酸F486可能起主要作用，因为它渗透到ACE2的深层疏水口袋。ACE2在从鱼类、两栖动物、爬行动物、鸟类到哺乳动物的整个动物界中广泛表达，具有保守的一级结构。结构分析表明，来自这些动物的ACE2可能结合2019-nCoV的RBD，使它们都可能是该病毒的自然宿主。新型冠状病毒被认为是通过呼吸道飞沫传播的。然而，由于ACE2主要在肠道、睾丸和肾脏中表达，因此粪便-口腔和其他传播途径也是可能的。最后，需要开发能够阻断ACE2与RBD相互作用的抗体和小分子抑制剂来对抗病毒。

关键词：冠状病毒，序列分析, 结构分析, 分子模拟

  1. 介绍

2019年12月下旬，中国武汉首次报道了一种神秘的肺炎疾病，并迅速蔓延到包括美国在内的十多个国家，在一个月内有数千人感染，数百人死亡。中国科学家已经从病人身上分离出病毒，并确定了其遗传密码。这种流行病的病原体是一种新的冠状病毒由世界卫生组织指定的2019 - ncov。2019 - ncov属于同一家族的病毒作为著名的严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARSCoV)和中东呼吸系统综合症冠状病毒(MERSCoV),已导致数百计的人丧生在过去的17年。

冠状病毒由大量不同的病毒家族组成。它们可分为4类:Alpha- 、Beta- 、Gamma-、delta-冠状病毒[2,3]。代表性的alphacoronavirus包括human coronavirus NL63 (HCoV-NL63)，而betacoronavirus包括最知名的SARS-CoV和MERS-CoV。基于核酸序列相似性，新发现的2019-nCoV为新型冠状病毒。所有冠状病毒进入宿主细胞是由穗状糖蛋白介导的，通过在其表面形成穗状结构，冠状病毒具有冠状外观。穗糖蛋白的氨基酸序列由一个大的外域、一个单通道跨膜锚和一个短的c端胞内尾[3]组成。外域包含一个受体结合单元S1和一个膜融合单元S2。电镜图像显示，穗糖蛋白形成一个具有三个S1头和一个三聚体S2柄的丁香状穗。对于病毒进入宿主细胞，S1通过其受体结合域(RBD)与特定的细胞表面受体结合，S2融合宿主细胞和病毒膜，使病毒基因组进入宿主细胞。特定的rbd受体结合决定了细胞或动物是否会被感染，同时也是治疗由冠状病毒引起的疾病的治疗发明的目标。先前的研究已经确定血管紧张素转换酶2 (angiotensin convertiase 2, ACE2)是SARS-CoV的功能受体[4,5]。在本研究中，我们分析了穗的结构糖蛋白RBD的2019-nCoV和确定了一个独特的特征，可能允许一个高亲和力结合到人类细胞ACE2。我们进一步讨论了2019-nCoV自然宿主的潜在候选宿主、传播途径和用于治疗的抑制病毒进入的策略。

  1. 方式

Wang等人保存的2019-nCoV基因组序列从GenBank数据库(MN908947.3)下载。用BLAST程序比较DNA和蛋白序列。利用Clustal Omega程序进行多序列比对。利用NCBI的Cn3D程序进行三维结构分析。采用基于人类ACE2共晶结构的Swiss-model与SARS-CoV spike糖蛋白RBD (6, PDB ID 2AJF)进行蛋白结构模拟。采用PatchDock和FireDock程序进行分子对接，分析ACE2与RDB的相互作用。

  1. 结果

3.1 .与SARS-CoV相比，2019-nCoV的一般序列特征

通过使用最初报告的序列MN908947.3，对NCBI数据库进行了一次BLAST搜索，发现该病毒的6个输入序列基本相同(登录为NC_045512.2、MN908947.3、MN975262.1、MN985325.1、MN988713.1和MN938384.1)。2019-nCoV的最近同源病毒是一种从蝙蝠(MG772933.1)中分离出来的sars样冠状病毒，在99%的覆盖率下序列同源性为87.99%(图1A)。它还显示了从人类患者或果子狸身上分离出的SARS冠状病毒的80%序列一致性，覆盖率为98%。在2019-nCoV的整个29903bp基因组中，保守度最低的区域编码了序列一致性为74e83%的穗糖蛋白。刺突糖蛋白在冠状病毒的表面形成刺突，负责病毒进入宿主细胞。穗状糖蛋白分子中的RBD直接与宿主细胞[3]表面的受体结合。在SARS-CoV和bat/civet SARS-like CoV的情况下，受体是ACE2，一种外肽酶，催化血管紧张素I转化为非肽血管紧张素1-9或血管紧张素II转化为血管紧张素1-7 [3e7]。在蛋白水平上，整个穗糖蛋白及其RBD与SARS-CoV的序列同源性分别为76%和72%。已知SARS-CoV穗状糖蛋白被糖基化。在2019-nCoV的穗糖蛋白中，共发现22个预测的n -糖基化位点，除了SARS-CoV在N370处含有一个额外的糖基化位点外，其余均由SARS-CoV共享。在蛋白水平上，SARS-CoV穗状糖蛋白的RBD与来自密切相关的冠状病毒的RBD的详细序列比对如图1B所。

3.2. 2019-nCoV中独特的RBD结构

SARS-CoV RBD与其受体人类ACE2复合物的晶体结构已被解决为[6]。通过分子模拟，我们得到了2019-nCoV的RBD的三元结构与SARS-CoV基本重合(图2AeC)，除了一个环路(环路2)有明显的结构变化。推导出的RBD结构的主干由7个beta薄片组成。参与二级结构形成的肽段均高度保守，不存在二级结构破坏分子。形成二硫键的四个半胱氨酸残基(对应于SARS-CoV的C366/C418和C467/C474)也被保存(见图1B)。我们进一步进行分子对接，检测RBD与ACE2的结合。推导出的复杂结构显示出与SARS-CoV类似的广泛相互作用模式，具有更有利的结合能(21.82 21 vs. 13.38 kcal/mol)(图2DeF)。ACE2和RBD之间的接触涉及两个b片和三个循环(见图1B和图2A)。SARS-CoV RBD中有16个氨基酸残基与ACE2直接接触，其中8个氨基酸残基保守于2019-nCoV(图1B)。据推测，取代氨基酸可以减少或增强相互作用。

图1:2019-nCoV与密切相关冠状病毒的比较。2019-nCoV与核苷酸序列中密切相关的冠状病毒的鉴别。给出了整个基因组的覆盖率和序列一致性，以及整个穗糖蛋白的编码区域及其受体结合域(RBD)的数据。B. 5个密切相关冠状病毒穗糖蛋白RBD的氨基酸序列比对。非典基因库加入数字AY2741 19(冠孤立在最初2002 e2003非典爆发,ref。8),为SARSv AY525636(冠孤立在2003年温和e2004爆发,ref。9), AY304486为猫(SARS-CoV-like病毒分离棕榈果子狸ref。10), AGZ48806.1为蝙蝠(SARS-CoV-like冠状病毒RsSHC014蝙蝠隔绝,ref。1 1),和MN908947.3 nCoV (2019 - nCoV)。在SARS-CoV RBD中与ACE2相互作用的氨基酸残基和其他病毒中保守的残基被标记为红色。主要的二级结构有下划线(b-sheet有双下划线)。在2019-nCoV中主要改变的氨基酸用绿色标出。形成二硫键的半胱氨酸残基和假定的n键糖基化位点分别用黄色和青色标出。

为了确定变异氨基酸对RBD/ ACE2相互作用的贡献，我们比较了其他三种sars - cov相关病毒的RBD序列(图1B)。这些病毒包括在2003年至2004年短暂而微弱的SARS爆发期间从病人身上分离出来的冠状病毒(这里指的是SARSv)和棕榈果子狸和蝙蝠身上分离出来的冠状病毒，它们可能是在人类身上发现的SARS- cov的来源[8e11]。已知含有这3种病毒RBD的重组蛋白均与人类ACE2结合[11,12]。与SARSCoV(导致了2002 - 2003年期间SRAS的主要暴发)相比，与SARSv和civet RBDs的结合显著减弱了[12]，而与bat RBD的定量结合亲和力尚未确定。RBD/ ACE2结合界面上的氨基酸残基在决定结合亲和力方面起着至关重要的作用。在SARS RBD中与ACE2接触的16个氨基酸残基中，有14个、14个、7个和8个分别被SARSv、civet、bat和2019-nCoV共享(图1B)。从两种SARS病毒中分离出的N479分别在果子狸和蝙蝠体内被转化为K和R。早前的一项研究表明，N479到K的替代导致明显的低亲和力(Kd值增加30倍)的[12]。有趣的是，这种氨基酸在2019nCoV中被类似的氨基酸谷氨酰胺(Q493)所取代，谷氨酰胺也含有一组氨基，但处于延伸位置，可能具有类似的功能。与SARS-CoV相比，T487在2019-nCoV中变为天冬酰胺(N501)，而在其他病毒中变为丙氨酸或丝氨酸。结果表明，T487对S的取代使Kd增加了20倍，说明在苏氨酸残基中，甲基比羟基更重要。很难预测含有酰胺基的N501是否能带来更好的相互作用。疏水氨基酸L472对RBD与ACE2的相互作用也很重要。有趣的是，它被SARSv中的脯氨酸和2019-nCoV中的苯丙氨酸所取代(对应于F486)。L472位于二硫键C467/C474形成的环内。有趣的是，SARSCoV中含有CTPPALNC的这个环被含有一个额外氨基酸残基和完全不同氨基酸组成的2019-nCoV中的CNGVEGFNC所取代。两个脯氨酸残基被两个灵活的甘氨酸残基取代，使一个刚性结构转变为一个非常灵活的结构。进一步对推导出的RBD/ACE2复合物结构进行研究发现，这种柔性回路中独特的苯丙氨酸F486可以深入到由F28、L79、Y83和L97组成的ACE2的疏水口袋中(图2F)。袋中存在的两个芳香氨基酸可能通过pstacking相互作用[13]提供额外的约束力。综上所述，2019-nCoV可能通过其穗状糖蛋白与ACE2有更强的结合。

图2:将已知结构SARS-CoV RBD及其ACE2配合物与推导出的2019-nCoV RBD分子模型进行比较。指出了一些结构片段和关键氨基酸残基。

糖基化也可能影响RBD与ACE2的相互作用。穗糖蛋白上的23个糖基化位点中，有2个位于RBD(图1B)。在这些残基之一的Asn330[6]上已经检测到糖基化。N330在2019-nCoV的穗状糖蛋白中与N343相对应，是一个保守的糖基化位点。由于它与RBD/ACE2相互作用的间期很好地分离，该位点的糖基化不太可能干扰相互作用[6]。应该注意的是,另一个潜在糖基化位点对应N357冠并不守恒在2019 - ncov因为thorn;2替换(T)的位置。在这后面的糖基化预计不会影响受体的结合。

3.3. ACE2在动物界的分布及其对病毒宿主的意义

  1. nCoV的爆发被认为是由一个海鲜市场引发的，该市场也有许多其他野生动物，包括蛇、鸟和各种哺乳动物。有趣的是，Ji等人的一项研究表明，基于nCoV-2019的密码子使用比他们研究的[14]的其他潜在宿主更接近于蛇，蛇可能是新nCoV-2019的一个可能宿主。虽然数据和前提还在争论中，但我们试图通过分析不同动物体内ACE2的结构来解决这个问题。ACE2在动物王国中广泛表达，从鱼类、两栖动物、爬行动物、鸟类到哺乳动物。值得注意的是，它的结构高度保守。比较人类ACE2与麝猫(Paguma larvata, AAX63775.1),蝙蝠(Rhinolophus sinicus, ADN93475.1),一只鸟(Nipponia日本KFQ92425.1),一条蛇(Protobothrops mucrosquamatus, XP_029140508.1),一只青蛙(非洲爪蟾蜍光滑的,XP_01810431 1.1),和一条鱼(Callorhinchus milii, XP_007889845.1)揭示了氨基酸序列的身份为83%,81%,83%,61%,60%,和59%,分别。图3根据已发表的共晶结构[6]对ACE2序列中包含与SARS-CoV RBD接触的所有相互作用位点的部分进行了比对。交互作用主要涉及ACE2的两个a-螺旋。在参与直接相互作用的20个氨基酸残基中，有4个被本研究分析的所有7种动物共享，包括可能与2019nCoV中穗状糖蛋白的F486相互作用的F28(图2F)。许多残留在接触物中的氨基酸被保存或被具有类似化学性质的氨基酸所取代。有趣的是，鸟类ACE2与蝙蝠和果子狸ACE2具有相同数量的保守接触氨基酸残基。其中任何一种ACE2分子都有可能与2019-nCoV的RBD发生高亲和力的相互作用。因此，如果发现这些野生动物中的任何一种是2019-nCoV的主要或次要宿主，也就不足为奇了。在许多被认为是病毒天然宿主的蝙蝠身上，已经发现了类似sars - cov的冠状病毒。它们很可能是2019-nCoV的宿主。然而，不能排除像蛇这样的冷血动物可以作为宿主的可能性。在我们的

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