植物寄生线虫 Nacobbus aberrans园艺土壤真菌的筛选和鉴定外文翻译资料

 2022-08-15 15:17:17

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植物寄生线虫 Nacobbus aberrans园艺土壤真菌的筛选和鉴定

摘 要

植物寄生线虫 Nacobbus aberrans 是一种内寄生虫，从北美到南美，对多种作物造成严重损失。天然拮抗真菌的使用被认为是减少该物种造成损害的一种可能的生物学控制方法。在水琼脂上体外评价了 66 种潜在的食线虫真菌对N. aberrans卵（J1）期和第二阶段幼虫期（J2）的拮抗作用。DGC 试验显示，某些分离的真菌的杀虫功效存在显着差异（p lt;0.0001），J1 和 J2 的寄生水平分别为 0-95 和 1-78％。根据在侵染宿主过程中菌丝和粘附分生孢子，五株淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum），罗伯茨绿僵菌 （Metarhizium robertsii）和 Plectosphaerella plurivora对 N. aberrans 拮抗作用最为有效。

图形概要

关键词 假根结线虫 园艺农业生态系统 食线虫真菌 体外试验

引言

科尔多瓦是阿根廷的第二大蔬菜生产国，占总产量的 16％。在该区域Riacute;oCuarto，叶用甜菜（Beta vulgaris L. var cicla）和根甜菜（Beta vulgaris L. var conditiva）分别占所有园艺蔬菜、主要园艺作物的 11％和 9％，一些植物寄生线虫（例如，Nacobbus aberrans）在生长季节会严重损害多种作物。这类线虫的寄主范围广泛，包括 18 个植物科，约 84个种，包括农作物和杂草。N. aberrans，也称为假根结线虫，主要影响马铃薯（Solanum tuberosum L.），番茄（Solanum lycopersicum L.），甜菜（B. vulgaris L.），辣椒（Capsicum annuum L.），和豆类（Phaseolus vulgaris L. ） 。 Doucet (1989)最初在里奥库亚托（Riacute;oCuarto）园艺区的Chenopodium album L.种植区发现了这种寄生虫的种群。然而，尽管采取了减少其密度的农业措施，但仍然在叶用甜菜和根甜菜中发现有该线虫（Sosa et al. 2015），N. aberrans形成的瘿与根结线虫属种引起的瘿相似。结果，被寄生的植物失去了吸收水分和养分的能力，从而降低了生长和产量水平(Talavera et al. 2001)。根据 EPPO，该线虫也被列为 A1 检疫害虫。

尽管存在一些主要基于寄主植物抗性的线虫管理替代方案，但它们与作物轮作，休耕和土壤灭菌等实践的整合不足。此外，农药对生物多样性的影响或对环境和人类健康的影响严重损害了这些生产系统的可持续性。

越来越多的注意力转向综合管理方法：将生物防治剂与适当的文化习俗，杀线虫剂或拮抗性植物提取物结合使用，并在必要时合理使用杀线虫剂，以将线虫种群密度降低至其经济阈值以下。

在限制或调节线虫种群方面，土壤生态系统的生物成分特别重要。作用机制包括竞争，寄生，捕食或产生有毒代谢产物。据报道，在几种土壤环境中，包括非培养土壤，存在着具有潜在生物防治活性的多种真菌(Jaffee 1992; Lopez-Llorca ，Jansson 2007)。

许多研究集中在寄生于 J2 线虫，雌性或根结线虫卵的真菌的作用上。物种属于许多属，包括镰刀菌属，小掘氏孢属，拟青霉属，普可尼亚属和木霉属。一些物种也可以在没有寄主的情况下生存，也可以作为腐生菌在土壤中繁殖，一些真菌也可能产生间接利益。Marro 等报告称，即使在有N. aberrans 存在的情况下，在移植阶段使用根内球囊霉（Glomus intraradices）促进了番茄气生和根生物量的增加，当根与土壤病原体竞争时，通过增加根的养分来提高生产力。此外，移植时接种了根内球囊霉（Glomus intraradices）的植物由N. aberrans引起的瘿数量减少了 56％。

因此，食线虫真菌（NF）是可以抑制包括动植物寄生虫在内的线虫种群的一类重要的土壤微生物。术语“食线虫真菌”（NF）在本文中用于描述具有感染和寄生线虫以获得营养能力的物种。根据其作用方式将 NF 分为四类，包括：（i）使用粘附或机械菌丝结构捕获线虫的真菌，（ii）使用感染性孢子的内寄生虫，（iii）菌丝尖端侵入卵的卵寄生真菌，以及（iv）侵入前固定线虫的产生毒素的菌种。基于上述考虑，本研究的目的是从园艺作物的根际中分离和鉴定天然 NF，并评估其对N. aberrans虫卵和 J2的拮抗作用。

材料和方法

采样地点

为了分离线虫和潜在的 NF，我们于2015年10月生长季从阿根廷科尔多瓦Riacute;oCuarto 的一个园艺区（33°06′21Prime; 南，64°15′ 41Prime; 西， 418m.s.n.m）采集土壤和根样品。在每个地点，从感染了 N. aberrans的叶用甜菜（B. vulgaris L. var。conditiva）和根甜菜（B. vulgaris）的根际土壤和非根际土壤中随机收集土壤样品（每个 500 g）。总共 20 个土壤样品在 50°C 下干燥 24 小时，根样品在 4℃保存。

线虫的分离，培养和鉴定

选择了具有地上部分具有寄生虫侵染症状（初期枯萎和发育迟缓）的单一叶甜菜植物，以获取线虫谱系用于进一步的测定。从仅包含雌性的单个根瘿中取出单个卵团，以建立接种N.aberrans用于以下实验。卵的表面用 1％ NaOCl 消毒 4 分钟，用无菌水冲洗，然后放在易感番茄（茄子番茄）的根上。然后在严格的检疫条件下，将番茄植株接种在无菌土壤和沙子（1：1）中，于 25plusmn;5°C 的温室中培养，接种后55 天，将植物更新（3 次，共 6 个月）以增加线虫的密度。此后， 提取N. aberrans种群进行形态学分析和分子鉴定研究，以及进一步的拮抗作用测定。

光学显微镜观察

从受感染根系获得的雌性进行了手工挑选和分析，并考虑了 Manzanilla-Loacute;pez 等人提出的详细特征。将 J2期线虫和单个卵块固定在 4％福尔马林的热溶液中，然后转移至纯无水甘油，使用光学显微镜对标本进行了测量，并根据前体、后体部分以及球茎对品种进行了命名。

分子分析

DNA 通过在缓冲液 Tris-HCl（pH 8-10 mM）中用玻璃珠（直径为 400 micro;m，美国 SigmaAldrich）研磨线虫 5 分钟来提取。用特异性引物 NEMF1（5CGCAAA TTACCCACTCTC3）和 REV1（5AGTCAAATTAAG CCGCAG3）进行 18S rRNA 的 PCR扩增。聚合酶链反应（PCR）以 25 micro;l 的体积进行。将 PCR 混合物添加到每个试管中：2.5 micro;l 10times;PCR 缓冲液（Promega），1.5 micro;l MgCl2，1 micro;l dNTP（每个10 mM）1 micro;l 10 pM 正向引物，1 micro;l 10 pM 反向引物，0.25 micro;l Taq 聚合酶（Promega），19.55 micro;l 蒸馏水和 5 micro;l DNA。所有 PCR 反应均在C1000 Touch Thermal Cycler（BioRad）中进行，其中 94°C，持续4分钟预变性，然后 94°C，持续 30 s，52°C，持续 30 s，72°C，30s，共35个循环。最后一步是72°C ，7分钟。在1.5％琼脂糖凝胶上检测扩增产物。依照制造商的说明，使用市售试剂盒（SV Gel 和 PCR Clean-Up System A9280a，Promega，USA）纯化DNA片段。由Macrogen，NL公司（韩国）对纯化的 PCR 产物上的每个分离物进行双向测序。使用 BioEdit ver软件对 sensus 和 antisensus 序列之间的重叠区域进行比对来产生保守序列。获得的序列以登录号 MH000315， MH000316 和 MH000317 上传到 GenBank 中。通过构建系统进化树来鉴定线虫的身份。树状图包括通过 BLAST2.2.32 比对获得的最接近的序列（88％或更高的相似性和 68％或更高的查询覆盖率）（Zhang et al.2000)。系统进化树使用最大似然法已在PhyML 程序（ v3.1 / 3.0 aLRT ）中重建。

真菌分离与鉴定

土壤种植方法是根据 Barra 等人提出的方法进行的。通过表面传播方法，通过将20份样品（其中10份来自根际土壤，10份来自非根际土壤）中的10 g土壤与 90 ml 0.1％蛋白胨水溶液混合，在固体培养基上进行真菌繁殖体的计数。在半选择性分离培养基（SM）上接种每份样品1times;10minus;6稀释液0.1 ml（玉米粉 17 g，NaCl 17.5 g，玫瑰红75 mg，triton X-100 0.3 ml，氯霉素 50ml，链霉素 0.1 ml，环己酰亚胺2.5 ml，琼脂–琼脂 15 g，蒸馏水1000 ml）, 25°C下孵育13天。真菌计数以个数log10每克土壤，将真菌在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上继代培养以获得纯培养物。

光学显微镜观察

根据亨伯（Humber）分类学的关键，通过宏观和微观特征鉴定了所有纯真菌培养物。分离的Metarhizium, Purpureocillium, Paecilomyces, Phialophora, Beauveria, Haplosporangium, Bionectria, Plectosphaerella 和 Verticiullium属的真菌进行生物防治测定。

再次通过分子参数分析了总共 15 种分离出的真菌， 它们在N. aberrans的 J1 阶段的感染水平高于 70％（见下文）。

分子分析

在无菌水中保存对 J1 表现出最高杀线活性的 15 个分离株。真菌在 PDA 上于 25°C 下生长 7 天。如Passone 等所述并进行了一些修改，收集菌丝体用于 DNA 分析。将每种真菌分离物的菌丝体等样品（50 mg）转移到离心管中，并在 1 ml 带玻璃珠（直径 456 micro;m，Sigma-Aldrich）的提取缓冲液中涡旋 5 分钟，以促进真菌物质的破坏。在65°C 孵育 60分钟后，向样品中加入1体积的氯仿，将其匀浆并在 13,000 rpm下离心10分钟。然后回收水相，并加入1体积的氯仿。将样品匀浆并再次以13,000 rpm离心10分钟。用1:10体积的乙酸钠（3M）沉淀水相，然后500 micro;l 异丙醇，在室温下孵育20分钟后，将其以13,000rpm 离心 10 分钟，并弃去水相。最后，用 70％ 的乙醇洗涤 DNA 沉淀，并将其悬浮在 25 micro;l 无核酸酶的 H2O 中。PCR（BioRad，Hercules，USA）在以下浓度的 50 micro;l 反应中进行：5 micro;l PCR 缓冲液（10times;， 含 1. 5 mM Mg2 ），2 U Taq DNA 聚合酶，300 micro;M dNTPs ，每个引物200 nM。使用的引物是真菌特异性的正向引物ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3）和反向引物 ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3）。PCR 程序如下：在 94°C 下初始变性 4 分钟，然后在 94°C下变性30 s，在 56°C下退火45 s，在 72°C下延伸1分钟，共35个循环，最后在72°C下延伸5分钟，将反应产物储存在 4℃。如前所述，通过在琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳确认 PCR 产物的存在，并从中纯化和测序。

体外拮抗试验

J1 感染

在立体显微镜下，通过从寄生的番茄根上刺破根瘿来去除卵块。然后将它们消毒（Tyler 1938）并放入装有10 ml水和 105 micro;l NaOCl 的锥形管中，剧烈搅拌 2分钟，然后浸泡5分钟。除去溶液，并在剧烈搅拌下用无菌蒸馏水冲洗虫卵（三次），然后将其转移至 0.1％链霉素，0.1％氯霉素和 0.1％环己酰亚胺溶液中（每次 10 分钟），在每个步骤中搅拌。最后，将虫卵在10毫升无菌蒸馏水中稀释，并使用Mc Master相机计数。

PDA上保留的 66 种真菌分离株的纯培养物用于本研究。从1周龄的培养物中切出琼脂块（直径2.5毫米），将其分别置于水琼脂（WA）（2％w / v）平板的中心，并在 25°C下孵育1周，直到菌落直径达到

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