以最小的副产物从木兰假丝酵母突变体R23提高赤藓糖醇生产菌株的选育及统计媒体优化外文翻译资料

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以最小的副产物从木兰假丝酵母突变体R23提高赤藓糖醇生产菌株的选育及统计媒体优化

Laxman S. Savergave，Ramchandra V. Gadre，Bhalchandra K. Vaidya，Karthik Narayanan

关键词：木兰假丝酵母，赤藓糖醇，发酵代谢产物的生产，造型，优化

摘 要

通过紫外线和化学诱变产生假丝酵母NCIM 3470的突变体，以增强赤藓糖醇的产生。在含有高浓度葡萄糖和2,3,5-三苯基四唑氯化物（TTC）的琼脂平板上筛选突变体以获得更高的还原酶活性。命名为R23的突变体之一，与14g L-1亲本菌株相比，产生最大的赤藓糖醇产生量，60.3g L-1。葡萄糖和酵母提取物被鉴定为关键的培养基成分，其决定了多元醇的产率，主要是赤藓糖醇，甘露醇和甘油的比例。为了增强赤藓糖醇的生产并使甘露醇和甘油的产生最小化，使用了响应面法（RSM）模型的四组分五级三级反应中心复合可旋转设计（CCRD）。发现赤藓糖醇生产的最佳培养基组合物含有（g L-1）葡萄糖238，酵母提取物9.2，KH 2 PO 4，5.16和MgSO 4 0.23。此外，使用RSM优化的培养基，在批量和补料分批模式下，在10L发酵罐中研究赤藓糖醇的产生。在补料分批发酵中，产生87.8g L-1赤藓糖醇，产率为31.1％，不形成任何其它多元醇。因此，涉及应变改进的媒介和工艺优化的本研究导致赤藓糖醇生产增加6.2倍，产率提高3.4倍。

介绍

赤藓糖醇是天然存在的四碳糖醇，用作食品级散装甜味剂。 它在水果和发酵食品中少量存在。 它是蔗糖的60-70％，其热值低于每卡0.2卡热量[1,2]。 已经允许赤藓糖醇作为增味剂，配方助剂，保湿剂，非营养甜味剂，稳定剂，增稠剂，螯合剂和增稠剂，其最高含量为100％。

通过化学方法工业规模生产赤藓糖醇包括使用镍作为催化剂在高温和高压下催化氢化淀粉，但由于其低效率，该方法尚未工业化[4]。 相反，生物合成途径提供了更安全和环保的赤藓糖醇生产的潜力。 赤藓糖醇可以使用属于Aureobasidium属的渗透性酵母，

假丝酵母属，Moniliella，毕赤酵母属，假酶，Trigonopsis，Trichosporon，Trichosporonoides和Yarrowia [2,5-7]。

据报道，广蚕根据生产多种多糖和有机酸，如赤藓糖醇，甘油，甘露醇，木糖醇，柠檬酸，葡萄糖酸，丁酸和乙醇[8-11]。有趣的是，木兰木兰产生的多元醇的组成取决于介质成分的性质，组成和浓度。

开发商业上可行的方法需要：（i）以最小量的干扰副产物以高产率和生产率进行应变，（ii）具有低成本营养物质的优化发酵培养基组合物，（iii）优化的工艺参数和（iv）缓解的下游加工产品回收[12]。中等优化的常规方法是费力和耗时的。此外，线性，这种方法不考虑发酵过程中操作变量之间的协同效应。这些限制可以通过应用基于统计的方法来克服[13,14]。

在不同的统计方法中，响应面法（RSM）已广泛用于媒体优化。使用RSM，可以通过将副产物保持在最小的可能水平来选择性地提高所需产品的生产。由于赤藓糖醇与多元醇混合物的分离是昂贵且繁琐的，所以RSM似乎是一种有吸引力的介质优化方法。

开展本研究以改善赤藓糖醇的生产，使副产物保持在最低的水平。

本研究的目的是通过诱变，然后通过培养基和工艺优化来改善甘蓝的赤藓糖醇生产，以最小化甘露醇和甘油的形成。

2.1材料和方法

2.1.微生物和媒体

C. magnoliae NCIM 3470是从National Collection of Industrial Microorganisms（NCIM），National Chemical Labora-tory，Pune，India购得的。 将培养物保持在麦芽提取物葡萄糖酵母提取物胨（MGYP）琼脂斜面上。 所有媒体均来自HiMedia，Mumbai，India。 N-甲基N-硝基-N-亚硝基胍（NTG），甲基磺酸乙酯（EMS），糖和糖醇购自Sigma-Aldrich，USA。

2.2.培养条件

将来自新鲜制备的斜面的各种培养物的圆圈充分接种到150mmtimes;25mm试管中的5mL液体发酵培养基（LFM）中，并在28℃，210rpm下孵育48小时。 将两毫升这些种子培养物无菌转移到含有22.5mL液体培养基的250mL锥形瓶中。 LFM由（g L-1）葡萄糖250，酵母提取物10，KH 2 PO 4 5和MgSO 4·7H 2 O 0.25组成。 将培养基的初始pH调节至6.0。 对于所有实验，葡萄糖分开高压灭菌。 所有实验一式三份进行，使用含有25mL培养液的250mL锥形瓶，在28℃下孵育，并以210rpm搅拌168小时，除非另有说明。 在孵育结束时，通过无菌蒸馏水将培养液的终体积调节至25mL。 以固定间隔取出样品，并在600nm，pH，残留葡萄糖和多元醇浓度下分析光密度。

2.3.诱变

在初始培养条件下，木薯NCIM 3470在LFM中产生14g L-1赤藓糖醇，产率为9.5％。 parm菌株在LFM中生长48小时。将培养液以10,000times;g离心，用无菌生理盐水洗涤细胞两次，悬浮后进行中和。通过使用Neubauer改进的细胞计数室（Marienfeld，Germany）在显微镜下通过计数细胞将细胞计数调节至1times;105个细胞mL-1。使用杀菌灯（日本Sankyo Denki Co.Ltd。，日本）将2毫升上述细胞悬浮液进行紫外线照射，距离20厘米为0-3分钟。对于化学诱变剂（EMS和NTG），用20mu;LEMS或50mu;LNTG溶液（2mM mL-1在50mM乙酸盐缓冲液pH5.5）中处理5mL具有1times;10 5个细胞mL -1的细胞悬浮液，用于0-60分钟在固定时间间隔内，将0.5mL过滤灭菌的5％硫代硫酸钠与0.5mL处理的细胞悬浮液混合以使EMS和NTG灭活。通过用UV照射细胞悬浮液30秒，然后EMS / NTG处理20分钟，结合UV和EMS / NTG处理。在诱变处理后，将含有约2000个处理细胞的20mu;L诱变细胞悬浮液铺展在具有400和600g L-1之间的葡萄糖/蔗糖浓度的LFM琼脂平板上。为了在一些突变系列中选择突变体的恒定的高选择压力，将板与200g L-1KCl与20g L-1糖一起掺入。将板与0.1g L-1 TTC一起筛选具有高还原酶活性的突变体。绘制生存曲线并用于获得90-95％的杀伤。

2.4.突变体的筛选

将处理细胞的板在28℃温育6至7天; 从板中选出菌落，其存活率为5-10％。 出现深红色的殖民地，选择与TTC结合的高渗透压琼脂平板上的尺寸更大，光滑，无色素和不粘性。 将选择的菌落接种在具有5mL LFM培养基的管中，在150mmtimes;25mm试管中，并以210rpm，28℃温育3天，并通过酶试剂盒分析残留的葡萄糖。 选择显示较高葡萄糖利用率的突变体与对照相比较，并在25mL培养基的锥形瓶中进一步评价。 选择具有增强的赤藓糖醇生产和基于HPLC分析的最小副产物形成的突变体并保持在LFM琼脂斜面上。

2.5用厚木兰突变体R23筛选赤藓糖醇生产的培养基成分

2.5.1碳源选择

来自LFM的葡萄糖被不同的碳源代替，包括蔗糖，果糖，甘油和葡萄糖 - 果糖混合物，以研究碳源对赤藓糖醇突变体R23产生的赤藓糖醇的影响。 碳源以250g L-1使用。 将各培养基用48小时种子培养物接种，并在旋转振荡器上于28℃，210rpm温育。 通过HPLC分析样品在168小时对于600nm处的OD，pH，残余葡萄糖和多元醇浓度。 通过将葡萄糖浓度从150升至400克L-1进一步研究葡萄糖浓度对赤藓糖醇生产的影响。

2.5.2.氮源效应

在摇瓶中评价氮源对赤霉病菌R23产生的赤藓糖醇的影响。 将两个半毫升的种子培养物接种在具有不同酵母提取物浓度为2至16g L-1的25mL培养基的250mL锥形瓶中，并在28℃，210rpm下孵育7天。 如前所述分析样品。

2.5.3.金属离子对C. magnoliae多元醇生产的影响

在具有25mL LFM的摇瓶中研究了金属离子（即Ca 2，Co 2，Cu 2，Fe 2，Mn 2，Mo 2，Zn 2和B 2）对多元醇生产的影响。 将主要为10,50和100mg L-1的三种不同浓度的痕量金属加入到含有LFM的单个烧瓶中。 将烧瓶温育168小时并分析生长和多元醇生产。

2.6.赤霉素NCIM 3470和突变体R23的赤藓糖醇生产比较

为了比较产生赤藓糖醇的突变体R23与亲本木兰，将各自的种子培养物如上所述在250mL锥形瓶中在25mL LFM中生长，并以24小时的规律间隔分析样品的OD，pH，残留底物浓度， 多元醇。 将葡萄糖摄取率，生产率和赤藓糖醇产量在烧瓶水平进行比较。

2.7.媒体组件优化：实验设计和统计分析

四个媒体组件 葡萄糖，酵母提取物，KH2 PO4和MgSO4用于本研究。 24次= 16加6个中心点加上8个（即2times;4）个星点的中心复合因子设计，总共进行了30次实验，一式两份。 每个烧瓶用2.5mL接种物接种并孵育7天，如前所述通过HPLC分析多元醇。

表1 自变量编码值

独立变量的编码值在表1中给出。三种依赖性响应（即赤藓糖醇，甘露糖醇和甘油的浓度）的值用于构建RSM模型。 使用“Design Expert”软件的试用版（Ver-sion 8.0.2.0，Stat-Ease Inc.，USA）计算和分析二阶多项式系数。 进行模型的统计分析以评估VAriance（ANOVA）的分析。 模型的总体预测能力通常由确定系数（R2）来解释。 通过F检验检验多项式模型方程拟合的统计学意义。 通过t检验测试回归系数的意义。 以Probgt; F值小于0.05 [15]给出显着性水平。

2.8.10升实验室发酵罐中赤藓糖醇生产的评估

在14L实验室发酵罐（New Brunswick Scientific USA）中，使用RSM优化的培养基进行三个连续发酵批次，以确定有效的赤藓糖醇生产所需的临界溶解氧（DO）浓度水平。三个连续批次的搅拌速度分别为300,450和600rpm。使用Mettler Toledo氧探针测量溶解氧。曝气速率和温度分别保持在0.5vvm和28℃。此后，进行补料分批发酵。最初，在生长期间将50g L-1葡萄糖和20g L-1酵母提取物溶液喂养至30h。在静止期开始时，将50％葡萄糖喂养至144小时，以维持低于25g L-1的残留葡萄糖

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