茉莉酸甲酯减轻采后枇杷的冷冻伤害和提高其抗氧化酶活性外文翻译资料

 2022-03-29 21:32:12

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茉莉酸甲酯减轻采后枇杷的冷冻伤害和提高其抗氧化酶活性

摘 要

在20℃下，用10 mol/L的茉莉酸甲酯（MeJA）对枇杷果实预处理24h，然后，在1℃条件下储存35天，并观察MeJA处理对枇杷果实冷害状况和抗氧化酶活性变化的影响。在贮藏期内，枇杷果实发生的冷害症状主要表现为果实硬度增强、出汁率下降和内部发生褐变。通过MeJA的处理，枇杷果实的冷害症状明显减轻。MeJA也显著减缓了O2-的产生速率和降低了H2O2的含量。与此同时，在贮藏期间经MeJA处理过的果实相比于对照组果实，其超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性和抗坏血酸过氧化物酶活性明显更高，而脂氧合酶活性较低。在MeJA处理过的果实中，不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的比率也明显高于对照组果实。这些结果均表明，用MeJA处理能够减轻果实冷害症状可能是抗氧化酶活性增强和不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸比率上升的原因。

关键词 枇杷果实；茉莉酸甲酯；抗氧化酶；脂氧合酶；脂肪酸

1 介绍

枇杷（Eriobotrya japonica Lindl）原产于中国亚热带地区，因其果实柔软多汁、营养丰富而深受全世界消费者的青睐。枇杷于炎热多雨的季节成熟，因其极易受微生物侵染和机械损伤，以及水分和营养较易流失，导致采后枇杷果实寿命极短。低温贮藏是一种常见的用来抑制枇杷果实腐烂，延长采后寿命的方法。然而，在1-5℃条件下，储存2-3周后，红沙枇杷果实会出现一些冷害症状，包括贴皮、变硬、木质化和内部褐变。这些冷害状况降低了枇杷的耐储性，导致消费者对这类枇杷的接受度降低。虽然有许多方法能减轻这类水果不良症状的发生，包括真空包装、低温贮藏和使用多胺、水杨酸或1-甲基环丙烯处理，但仍有必要去研究更为有效的枇杷贮藏保鲜技术。

冷害是一种重要的采后病变，它降低了枇杷的整体品质，削弱了枇杷在亚热带水果销售市场上的竞争力。冷害症状的发生可能是因为活性氧（ROS）引起膜脂过氧化作用，导致不饱和脂肪酸在膜脂中分解。但是从另一方面来说，ROS清除剂增加了极性脂类中18种碳脂肪酸的不饱和度，又可作为抗氧化剂减轻冷害的严重程度。ROS的代谢受相关的抗氧化酶的调控，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）。超氧阴离子自由基O2-在超氧化物歧化酶SOD的作用下高效转化为H2O2，然而H2O2则主要被CAT和APX分解。已有研究表明，果实抗氧化酶活性与耐冷性呈正相关。Lipoxygenase（LOX）能够催化分解多不饱和脂肪酸，引起膜脂过氧化作用，损伤植物组织细胞膜结构，导致冷害症状发生。例如发生冷害症状的黄瓜果实中的LOX活性增强。这些结果均表明，抗氧化酶活性的增强和膜脂过氧化作用的降低可能加强采后果实的耐冷性。

茉莉酸及其挥发性甲酯即茉莉酸甲酯（MeJA）是一类环戊酮化合物，它是调节应激反应和植物生长发育的重要内源性调节因子。在最近的研究中发现，MeJA已被用来减轻许多园艺作物的冷害症状，如芒果，甜椒和番茄。因此，在果实采后病变治疗中，MeJA对缓解冷害症状和保持果实品质有潜在作用。最近，我们发现用10mu;mol/L的MeJA处理果实可有效缓解枇杷果实冷藏后的冷害症状。然而，MeJA在缓解冷害症状和防止品质恶化方面的作用机制尚未明确。因此本项研究的目的就是明确MeJA处理对抗氧化系统活性和脂肪酸组成变化的影响是否与枇杷果实耐冷性的增强有关。

2 材料及方法

2.1 植物材料及处理

在枇杷成熟期内，从中国江苏果园手工采摘果实，并在2小时内运输到实验室。先选择颜色大小统一，外部无明显缺陷的果实，然后随机将其分成两批。第一批果实在20℃下，于密封室中用10mu;mol/L的MeJA处理24小时，而第二批果实在相同条件下处理但不使用MeJA（对照）。处理完后，打开密封室，将两批果实在约1℃条件下，以95％的相对湿度保存35天。每次处理重复三次，每次处理五公斤水果。在MeJA处理后（时间0），每隔7天取出一次果实样品，测量果实硬度、可提取汁液、内部褐变指数、超氧阴离子O2-的产生、H2O2含量、脂肪酸组成、以及SOD、CAT、APX和LOX活性状况。

2.2 测定果实硬度，可提取果汁率和内部褐变指数

用具有5mm直径探针的TA-XT2i质构分析仪（Stable Micro System Ltd.，UK）以1mm/s的速度，测量测量每个样品的果实硬度。

出汁率是根据低速离心对组织塞造成的重量损失来估计的。将四个木塞（7mm宽和10mm厚）附上无菌棉纱并置于50ml离心管上，在室温下以1700g离心10分钟。称重前后的差值即为枇杷果实组织的鲜重损失。

内部褐变主要表现为在核心附近组织会变成褐色，所以可以将果实纵向切成两半，然后目视评估。对于每种水果，内部褐变指数（IB）可按照5个等级进行评分：0 =无；1 =轻微；2 =中等；3 =中等严重；4 =严重。所以可用以下IB计算公式计算：IB指数（在0和4之间）=[(IB等级)times;（该IB等级的果实数）]/（处理的果实总数）。

2.3 O2-和H2O2的测量

对O2-产生速率的测量可参考Elstner的方法并进行一些修改。首先将5g果肉组织在5mL 的50mmol/L的pH7.8磷酸盐缓冲液中研磨。将研磨后的匀浆在4℃条件下以10000g离心20分钟。离心所得的上清液即可用来测定O2-的生成。之后将1mL的 1mol/L羟基氯化铵和1mL粗提取液混合均匀，在25℃下孵育1小时。 然后继续向混合液中加入2mL乙醚以防止叶绿素的干扰，并将混合液以10000g离心5min。之后，从离心后的水层中取1mL离心液，滴加17mmol/L的对氨基苯磺酸（在冰醋酸：H2O= 3:1中）和7mmol/L的alpha;-萘胺（在冰醋酸:H2O = 3:1中）各1mL，并将反应液置于在25℃下再保温20分钟，然后立即测量530nm处的吸光度。O2-的产生速率可用亚硝酸钠作为标准物制作的标准曲线来计算，并用nmol/g FW/min表示。

测定H2O2，可将2g新鲜枇杷组织与5mL冷却的100％丙酮均匀混合，然后在4℃下以10000g离心20分钟。离心后，参考Patterson，Mackae和Ferguson等人的方法，立即收集上清液用于H2O2分析。H2O2含量可用nmol/g FW表示。

图1.在1℃条件下， MeJA对枇杷果实贮藏过程中果实硬度（A），可提取果汁（B）和内部褐变指数（C）的影响。硬度和内部褐变的值是每种十个果实的三份样品的平均值plusmn;SE。可提取汁液的数值是三重测定的平均值plusmn;SE。数据上的竖线表示测量的标准误差。

2.4 酶分析

所有酶的提取步骤都是在4℃条件下进行。对于SOD活性的测定，首先将1g果肉组织置于5mL的50mmol/L的pH7.8磷酸钠缓冲液中研磨。测量CAT活性，则用5mL的 50mmol/L的pH7.0磷酸钠缓冲液与1g的果肉组织混合研磨。测量APX，则用5mL的50mmol/L的pH7.0磷酸钠缓冲液（其中含有0.1mmol/L EDTA，1mmol/L抗坏血酸和1％聚乙烯吡咯烷酮）与1g果肉组织研磨。对于测量LOX，则将5g果肉组织与5mL的50mmol/L的 Tris-HCl溶液（pH8.0，其中含有10mmol/L的KCl溶液，500mmol/L的蔗糖溶液和0.5mmol/L的苯基甲基磺酰氟）在4℃条件下混合研磨。然后将以上研磨后的匀浆提取物在4℃下以10000g离心20分钟。离心后的上清液则用于各种酶分析。

SOD活性参考Rao，Paliyath和Ormrod的光化学方法测定。反应液包括总体积为3mL的50mmol/L的磷酸钠（pH7.8），14mmol/L的甲硫氨酸，3mu;mol/L的EDTA，11mu;mol/L的硝基蓝四唑（NBT），60mu;mol/L的核黄素和0.1mL的粗酶提取液。通过记录560nm处的吸光度来监测蓝色甲的形成。在实验测定条件下，抑制NBT降低50％的酶的量就被定义为1个酶活力单位。

CAT活性可参考Chance和Maehly的方法测定。一个单位的CAT酶活力定义为每分钟分解1mu;mol的H2O2的酶量。

APX活性可按照Nakano和Asada的方法测定。一个单位的APX酶活力被定义为每分钟氧化1mu;mol的抗坏血酸的酶量。

LOX活性可使用Todd，Paliyath和Thompson的方法测定。一个单位的LOX被定义为当使用亚油酸作为底物时，在25℃下在234nm处引起吸收度每分钟增加0.01的酶的量。

按照Bradford的方法，使用牛血清白蛋白作为标准物来估计酶提取物中的蛋白质含量。酶的比活性表示为每毫克蛋白质所具有酶的活力单位数。

2.5 脂肪酸定量

总脂质的提取可按照Valero，Loacute;pez-Friacute;as，Lloacute;pis和Loacute;pez-Jurado的方法。简而言之，就是将20g果肉组织均匀混合在10mL氯仿：甲醇：0.1N HCl（200：100：1）的溶液中，然后加入10mL的 0.1N的 HCl，然后在4000g下离心10分钟。接着收集有机相并使其干燥。通过在沸腾温度下加入1mL三氟化硼/甲醇，进行脂肪酸的甲基化反应（10min）。用己烷提取甲基化后的脂肪酸，取出后在注射前重新溶解于200mu;L氯仿中。根据Mirdehghan等人的方法通过配备有火焰离子化检测器（FID）的气相色谱（GC，Hewlett-Packard model 6890）进行脂肪酸的分离和定量。通过比较保留时间和峰面积进行脂肪酸的鉴定和定量。通过下式计算不饱和/饱和脂肪酸的比率：（18:1 18:2 18:3）/(16:0 18:0)，其中16:0=棕榈酸；18:0=硬脂酸；18:1=油酸；18:2=亚油酸；18:3 =亚麻酸。

2.6 统计设计

实验采用完全随机化设计。所有统计分析均采用SPPS（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）进行。数据通过单因素方差（ANOVA）进行分析。利用Duncan的多重范围测试进行平均分离。plt;0.05时差异较为明显。

3 结果

3.1 冷害症状的发生

枇杷果实的冷害症状（图1）可用果实硬度，内部褐变和出汁率来评估。成熟的枇杷果肉柔嫩多汁，然而，在冷藏期间，大多数水果都趋于软化，但枇杷果实硬度却在增强但出汁率下降，这就导致枇杷果实木质化，食用品质降低。对照组果实在1℃条件下贮存21天后，果实木质化程度较为严重且内部褐变指数较高。但是，用10mu;mol/L的 MeJA处理则明显（P lt;0.05）抑制果实变硬和内部褐变，并且还保持了较高的出汁率，从而延缓冷害症状的发生和维持果实品质。

3.2 MeJA处理对O2-产生和H2O2含量的影响

在最初冷藏的14天内，对照组和MeJA处理组果实的O2-和H2O2水平保持相对稳定，并没有太大差异。此后，两组的O2-和H2O2含量迅速增加，但很明显的是，用10mu;mol/L MeJA处理（P lt;0.05）可抑制O2-和H2O2水平的增加（图2）。在贮藏的第35天，对照组果实中的O2-和H2O2含量分别比MeJA处理组高21.8％和22.8％。

图2 ：枇杷果实在1℃贮存期间，MeJA处理对O2-（A）和H2O2（B）水平的影响。数值是三重测定的平均值plusmn;SE。数据上的竖线表示测量手段的标准误差。

3.3 MeJA处理对SOD、CAT、APX和LOX活性的影响

对照组和MeJA处理组果实中的SOD活性虽然都随贮藏时间的增加而增加，但是用MeJA处理的果实在整个贮藏期间明显保持较高的SOD活性（图3A）。枇杷果实的CAT和APX活性的变化在冷藏期间也表现出相类似的情况。对照果实中这两种酶的活性在贮藏的前7天内略有增加，之后却逐渐减弱。但明显

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