摇蚊水生幼虫解毒系统基因暴露于抗菌剂-三氯生中的影响外文翻译资料

 2022-03-29 21:56:16

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摇蚊水生幼虫解毒系统基因暴露于抗菌剂-三氯生中的影响

摘 要

三氯生是一种抗菌剂，被广泛用于一系列的个人护理产品中，常在水生生态系统中被检测到。在本研究中，我们评价了TCS对一种广泛应用于毒理学评估的水生实验生物-摇蚊水生幼虫的解毒系统在分子水平的影响。结果表明，这种异型生物质能够诱导不同细胞色素P450s和谷胱甘肽-转移酶基因的内部片发生显著的变化，分别涉及解毒系统的第I期和第II期。相反，TCS并不影响谷胱甘肽s -转移酶。多药耐药蛋白1的活性及表达模式，属于脱毒系统的第三期。相比之下，TCS并不影响谷胱甘肽s -转移酶活性，也不影响多药耐药蛋白1的表达模式，该蛋白1属于解毒系统的第三期。这些结果提供了关于TCS对摇蚊水生幼虫的解毒机制的影响的信息，并提供了不同的生物标记基因，这些基因在生态毒理学研究、风险评估和生物修复中都有着十分重要的作用。

  1. 介绍

三氯生是一种被广泛地应用在药物和个人护理产品的抗菌剂，也是一种新型的环境污染物。三氯生(5-氯-2- 2,4-二氯苯氧基苯酚或TCS)是一种广谱抗菌剂，广泛应用于兽医、工业和家用产品(如除臭剂、洗发水、牙膏、漱口水、消毒剂、肥皂、洗涤剂、化妆品、纺织品和塑料添加剂)。近几十年来，随着TCS的使用越来越广泛，在水生环境和陆地环境中被检测出，在人尿、血浆和牛奶中也有检测到。TCS是最常见的十大有机废水化合物之一。然而，尽管美国国家环境保护署在2008年9月，美国食品和药物管理局在2008年9月对美国食品及药物管理局的使用，美国食品和药物管理局禁止销售含有TCS的肥皂。

之前的研究报告称，TCS会引起两栖动物和大鼠体内荷尔蒙的稳态紊乱。这种异型生物质在人类细胞培养中扮演内分泌干扰化学物质（EDC），并影响青蛙、老鼠和昆虫体内激素受体基因的基因表达谱。此外，TCS在软体动物、昆虫、环节动物、原生动物、甲壳类动物和鱼类体中可诱发DNA损伤。

尽管近年来关于TCS环境毒性的数据量有所增加，但关于这种异型生物质对无脊椎动物的解毒系统的基因和酶的反应可能产生的影响的研究，尤其是在生态毒理学研究中非常重要的双翅昆虫，是很少见的。在水生毒物学的评估中，摇蚊水生幼虫是最常用的作测试生物之一。摇蚊幼虫是最普遍的淡水底栖无脊椎动物之一，在生态学上与水生食物链息息相关。摇蚊正被广泛用于分子端点进行毒性测试，例如用于监测环境质量和居住在污染生态系统中的生物的健康的基因生物标记。近年来，在摇蚊中，一些基因被描述为对不同的水生污染物进行评估的生物标志物，其中包括对热休克蛋白(HSPs)、核糖体蛋白、细胞色素P450s和核受体的编码。

据报道，在无脊椎动物中，TCS增加了解毒、抗氧化剂的活性和防御系统的抗压能力。一般来说，解毒代谢系统包括第一阶段(功能化)、第二阶段(共轭)和第三期(排泄)。在解毒系统的不同组成部分中，细胞色素P450 (P450)和谷胱甘肽s-转移酶 (GST)酶在保护细胞抗击有毒物质的过程中发挥着核心作用。P450酶是排毒系统第一阶段最重要的酶，主要是对内源性和外源性化合物的降解和消除起作用。GSTs是解毒系统中最重要的第二阶段酶，它能够结合还原性谷胱甘肽与毒性化合物的亲电中心。尽管近年来TCS潜在的毒性影响的数据量有所增加，但主要集中在生物化学和酶反应的评估上，关于水生生物的解毒系统相关基因的反应却缺乏相关信息。因此，本研究的目的是分析TCS对在摇蚊水生幼虫中的解毒系统的影响。因此，我们选择了CYP4D2、CYP6B7、CYP9F2、CYP12A2、GSTd3、GSTd6、GSTe1、GSTo1和GSTt1基因，参与了解毒系统的第I期和第II期，对其转录谱进行了评价。

另一方面，多药耐药相关蛋白1(MRP1)涉及多种异种耐药机制和三期排毒系统，在保护细胞对抗多种毒性物质到亚致死水平方面发挥了积极作用。该蛋白属于ATP结合盒(ABC)转运蛋白超家族，并从细胞中提取内源性代谢物和异型生物质污染物。MRP1能有效降低有毒化合物的细胞内浓度，保护暴露的有机体免受毒性作用。在本研究中，MRP1基因的转录活性已被评估，目的是分析TCS对MXR机制的影响。

总之,现在的工作的目的是分析TCS的影响基因转录活动的第一阶段,和解毒系统的第二阶段,它的影响的基因编码的ABC泵参与活动流出各种内源性和异型生物质基板。这是在无脊椎动物中评估一套解毒系统相关基因的首批研究之一，目的是帮助阐明其代谢途径所涉及的机制，并进一步了解这种化合物对水生生态系统的环境影响。

2材料和方法

2.1 化学药品和试剂

氯生(TCS)和GST工具包是从西格玛购买的。以乙醇为原料，在培养基中进行稀释，以获得TCS的实验浓度。2.2 动物

实验动物是四龄幼虫，来自摇蚊属。他们最初是从自然种群中采集的，根据毒性试验的指导原则，经几代人的实验室条件培养获得了了一种低标准的实验室培养物。用培养基(0.5 mM CaCl 2 , 1 mMNaCl, 1 mM MgSO 4 , 0.1 mM NaHCO 3 , 0.025 mM KH 2 PO 4 , 0.01 mMFeCl 3 )，补充荨麻叶，商业鱼食，和纤维素组织，在20摄氏度的持续曝气和16:8的标准光暗条件下培养。

2.3 处理

根据之前在摇蚊和其他生物在细胞培养环境下检测到的浓度，选择剂量。在实验处理中，第4龄幼虫暴露于稀释浓度为10 g/L、100 g/L、1000 g/L TCS中，在20°C恒温培养基中培养24小时。在TCS处理期间，不给幼虫提供食物或营养基质。在每个分析中分别用不同卵块的样本进行了三个独立的实验。在每一项实验中，都用10个幼虫来进行每次处理，其中3个是随机选择的RNA提取，每一个都单独进行，其中5个是随机选择的GST酶活性分析。所使用的幼虫被暴露在相同浓度的溶剂中(乙醇0.033%)作相应的处理，同时评估也为一式三份因此，在相关实验中获得的三个独立幼虫的数量是n = 9用于mRNA表达分析和n = 15用于GST活力评估。未经处理的幼虫,幼虫暴露在TCS中存储与minus;80°C条件下直到RNA和蛋白质完全分离。

2.4 RNA分离和逆转录

RNA分离和反转录过程是按照我们小组之前工作的步骤进行的。

2.5 定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)

cDNA作为定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)的模板，用于评估CYP4D2、CYP6B7、CYP9F2、CYP12A2、GSTd3、GSTd6、GSTe1、GSTo1、GSTt1和MRP1的mRNA表达谱。为了验证每个放大器的精度，在扩增后进行了熔化曲线分析。本研究以甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和核糖体蛋白L13 (rpL13)为对照基因，对靶基因的转录表达进行规范化，因为它们呈现了变异系数 lt; 0.25、m 值 lt; 0.5。所有特定的引物都与前面描述的相同。通过校准曲线建立了PCR扩增效率，对每一种基因，采用三倍的方法制备了一种基于五种稀释剂的标准曲线，以验证扩增效率。为了验证只有一个DNA片段的扩增，在扩增后进行了熔融曲线分析。每个样本都是在重复的井中运行，每个实验使用三个独立的PCR复制。使用 2 minus;Delta;Delta;Ct方法和BioRad CFX管理器3.1软件，将循环阈值（Ct）值转换为相对基因表达水平，以分析基因表达。

2.6 谷胱甘肽s -转移酶活性

为评价谷胱甘肽s -转移酶(GST)活性，在TCS实验后24小时收集了5个对照组幼虫和5个处理过的幼虫。根据我们组前期工作的程序进行蛋白分离和GST活力鉴定。

2.7 统计分析

每个样本的CYP4D2、CYP6B7、CYP9F2、CYP12A2、GSTd3、GSTd6、GSTe1、GSTo1、GSTt1和MRP1 mRNA水平均以标准曲线为基础，以GAPDH和rpL13 mRNA的表达为标准。在GST酶活性方面，与未暴露对照组相比，处理组GST活性的同一水平。对数据的正态分布和方差齐性进行了分析。在此基础上，通过多重比较试验的方差分析测试，比较了非暴露控制和处理后的幼虫之间的显著差异。Ap值le;0.05(*),p值le;0.01(* *)被认为是具有显著差异。所有的统计测试都是使用SPSS24(IBM)进行的。结果表示为平均值plusmn;标准平均误差(SEM)三个实验,在这三个个体摇蚊水生幼虫进行评估和除去了最高和最低值得到控制和处理组分析结果。

3.结果

3.1 TCS暴露对细胞色素p450基因表达的影响

为了评估TCS对CYP4D2、CYP6B7、CYP9F2和CYP12A2基因表达的影响，在摇蚊水生幼虫中对mRNA的表达进行了评估，并对其进行了24小时的评估。这些基因编码的酶参与解毒阶段I，在防御各种环境毒物中扮演重要角色。通过qRT-PCR对mRNA水平进行分析，并与对照基因GAPDH和rpL13进行规范化。在每一种情况下，转录活动都与在同一浓度溶剂中观察到的对照动物进行比较。如图1所示，这些细胞色素P450基因的基因表达模式与对所有浓度的控制的基因相似，除了CYP12A2基因，其mRNA表达量增加到TCS 10g/L，显示出mRNA水平恢复的趋势，类似于控制两个最高剂量的基因。

3.2 TCS对谷胱甘肽-转移酶基因表达的影响

在本研究中，我们分析了TCS对5个GST基因表达的影响，该基因编码了主要的II型解毒酶。用qRT-PCR方法对摇蚊水生幼虫中GSTd3、GSTd6、GSTe1、GSTo1、GSTt1的转录活性进行了评价，对照组的幼虫和处理组暴露于10 g/L、100 g/L、1000 g/L的TCS中。结果表明这种异型生物质GSTd3的mRNA水平增加,GSTe1和两个低剂量GSTo1基因分析和GSTt1基因100mu;g / L。相比之下,GSTd6基因的表达下调后24小时的暴露在1000mu;g / L的TCS。

3.3 TCS暴露对MRP1基因表达的影响

为了检验MRP1基因对TCS暴露的转录响应，通过qRT-PCR分析控制组和处理组幼虫的mRNA水平，并在标准化后，避免对GAPDH和rpL13 mRNA水平的采样数据产生随机影响。如图3所示，MRP1基因的转录活性在1h /L TCS暴露24小时后增加，但这一变化并不显著。

3.4 TCS对谷胱甘肽s -转移酶活性的影响

此外，还对GST的活性进行了分析，以评估TCS对主要二期解毒酶的影响，这些酶在对抗各种环境毒物的过程中发挥着中心作用。如图4所示，暴露于TCS的幼虫与GST活动的控制幼虫之间没有明显的变化。

  1. 讨论

解毒系统是可能在受到环境污染物影响后的生理途径之一。到目前为止，关于TCS对水生无脊椎动物代谢途径的分子水平作用的信息很少。据我所知，只有两篇论文报告说，TCS能够改变无脊椎动物排毒系统相关基因的转录模式。因此，本研究提供了关于TCS的毒性效应的新数据，分析了与这些代谢途径相关的一组基因的表达。

CYP基因家族编码P450酶，是最多产的基因家族之一。在昆虫中，CYP基因被分配给6个基因家族，其中5个是昆虫特异性的(CYP6, CYP9, CYP12,CYP18, CYP28)， 1个(CYP4)包括脊椎动物的序列。最近，有人已经鉴定并描述了四种细胞色素P450s属于摇蚊中四种不同的酶系(CYP4D2, CYP6B7, CYP9F2和CYP12A2)之一，可以认为其在昆虫解毒系统中是极具代表性的。据报道，P450酶具有多种功能，但在昆虫的生理和毒理过程中，它们的复杂作用鲜为人知。许多昆虫P450蛋白都是内源性化合物的代谢产物，如蜕皮激素、青少年激素或脂类，但它们的重要性大多与异源生物质的代谢和解毒有关。虽然摇蚊被广泛用于生态毒理学研究，但在这些生物中，关于CYP基因或P450酶的研究有限。迄今为止，摇蚊水生幼虫只有两个CYP基因(CYP4G和CYP9AT2)报道，不同的外源性物质改变了他们的转录谱，尽管有最近报道说紫外滤光剂苯并酮-3和4-甲基苄基甲基苯并修饰了CYP4D2、CYP6B7、CYP9F2和CYP12A2的mRNA水平。在这项工作中，CYP4D2、CYP6B7、CYP9F2和CYP12A2的转录反应在接触TCS后进行了评估，TCS是一种抗菌药物，广泛应用于许多药物和个人护理产品中。目前的结果表明，这种外源性物质无法改变CYP mRNA水平，除了CYP12A2基因。与此相似的是，在家蝇中CYP12A1基因代谢了多种杀虫剂和其外源性物质，但没有代谢蜕皮激素、青少年或脂肪酸。另一方面，TCS在单纯性诱导CYP3042A1和CYP3043A1基因的mRNA表达，但相比之下，CYP3026A3和CYP3037A1在明显增加。TCS作为一种非典型诱引物，在剑尾鱼的剑尾鱼上进行I期代谢基因，然而，TCS在小鼠新皮质神经元中的CYP1A1和CYP1B1的mRNA水平下降，而在黄鲶鱼的剂量和时间暴露上，TCS的表达方式有所差异，CYP1A和CYP3A表达模式也有所不同。因此，在TCS暴露后CYP基因的不同表达模式可能是由于大量的基因和P450酶的各种功能决定。

对于GST酶，这些蛋白显示了广泛的底物特异性，其表达可以通过暴露于外源化合物来调节，这表明它们参与了对化学胁迫的适应性反应。GST酶的诱导化合物可以是

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