提高酶产量的黑曲霉的形态工程外文翻译资料

 2022-04-10 22:26:35

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提高酶产量的黑曲霉的形态工程

Habib Driouch, Becky Sommer, Christoph Wittmann

Institute of Biochemical Engineering, Technische Universitauml;t Braunschweig, Gauszlig;straszlig;e 17,

38106 Braunschweig, Germany; telephone: t49-0-531/391-7650; fax: t49-0-531/391-7652;

e-mail: c.wittmann@tu-bs.de

摘要：在深层培养中，添加硅酸盐微粒作为控制黑曲霉（Aspergillus niger）的形态发育的新方法，作为柠檬酸和高价值酶的主要世界来源是非常重要的。随着微米材料的大小和浓度的细微变化，可以重现地产生许多不同形态的形式，包括不同大小的颗粒，自由分散的菌丝体和短的菌丝碎片。氧化铝颗粒同样影响形态，表明这种效应在很大程度上与化学颗粒组成无关。在培养过程中黑曲霉形态发育的图像分析表明，微粒影响形态，通过碰撞诱导破坏分生孢子聚集体，并且可能也是在该过程的最初阶段阻碍新的孢子-孢子相互作用。对于不同的重组黑曲霉菌株的例子可以通过添加微粒来强烈地增强酶的产生。与形成自由分散的菌丝体相关联的是，在摇瓶中，表达为胞内酶（88U/mL）和分泌到上清液中的呋喃果糖苷酶（77U/mL）的葡糖淀粉酶（GA）的滴度高达四倍。此外，不需要的副产物草酸盐的积累被抑制达90％。该微粒方法可以成功转移到生物反应器中生产呋喃果糖苷酶，最终效价可达160U/mL。使用GA与绿色荧光蛋白的共表达，酶产生定位于黑曲霉的细胞聚集体中。对于颗粒状生长，蛋白质产量仅在颗粒表面的薄层内最大，在颗粒内部明显减少，而与微粒的相互作用产生高度活性的生物催化剂，其中细胞的主要部分有助于生产。

关键词：微粒；淹没培养；丝状真菌颗粒；菌丝球；菌丝

引言

丝状真菌的一个突出的但最具有问题的特征是其在深水培养中的复杂形态。因此，生物技术过程中的生产力往往与形态形式相关（Kaup等，2007; Petzoldt，1971; Zhang等，2007; Znidarsic和Pavko，2001）。例如，生产衣康酸（Metz，1976）或柠檬酸（Gomez等，1988）时，颗粒生长是最佳的。在其他情况下，自由分散的菌丝体似乎是最佳的，并被当做确保高生产力的先决条件（Papagianni和Mattey，2006）。这适用于淀粉酶，新果糖转移酶或肌醇六磷酸酶（Teng等，2009）或青霉素生产（Vecht Lifshitz等，1990）等酶的生产。在培养过程中，菌丝体形式允许细胞的氧供应，从而刺激了生长和生产（Wittler等，1986）。因为正确形态学会控制丝状真菌的生长特性，因此对其具备良好性能是极其重要的。选定的研究包括操作参数如接种量，搅拌速度或pH值的变化（Bocking等，1999; McIntyre等，2001; Nielsen，1996; Papagianni和Mattey，2006）。或者，通过随机诱变和选择具有受影响、能增强的半纤维素分解酶产生的形态的突变体获得所需的形态学特征（De Nicolas-Santiago等人，2006; Wang等人，2005）。然而，在许多情况下，这些尝试要求与最佳生产不同的条件，如极端pH值导致酶不稳定或高搅拌速度，导致能量成本增加。在一项开创性研究中，在培养基中加入无机微粒会影响真菌形态（Kaup等，2007）。如Caldariomyces fumago所示，添加氧化铝或含水硅酸镁等微粒导致细胞分散达到单菌丝水平并增强氯过氧化物酶的产生。作者表明微粒同时会影响其他丝状真菌的形态，这表明在培养基中添加某些物质通常会刺激丝状真菌的生长。

在丝状真菌中，黑曲霉（Aspergillus niger）是世界柠檬酸和较高价值的酶产物（包括果胶酶，蛋白酶，淀粉葡糖苷酶，纤维素酶，半纤维素酶和脂肪酶）的主要来源（Jones，2007）。对于曲霉属菌种，分散的菌丝体悬浮液常常得到较高的产物产量，因此优于颗粒形式（Bocking等，1999; Gibbs等，2000）。在这方面，目前的工作涉及使用微粒控制产生重组酶b呋喃果糖苷酶（EC 3.2.1.26）和葡糖淀粉酶（GA）（EC 3.2.1.3）的不同黑曲霉菌株中的形态。在硅酸盐基微粒存在下，使用图像分析以不同粒径和浓度研究了黑曲霉的所得形态。该筛选允许鉴定关于生产性能的最佳条件，然后可以利用该条件来显着优化蛋白质生产。在黑曲霉中加入在相同启动子的控制下共表达GA和GFP（绿色荧光蛋白）的突变体，第一次看到微粒对形成的细胞聚集体中的蛋白质产生的空间分布的影响，这表明其明显改变了黑曲霉的基础代谢。

材料和方法

菌株和维护

在本研究中，使用了三种黑曲霉重组菌株。 黑曲霉AB1.13是一种尿苷营养缺陷型、蛋白酶缺陷和由黑曲霉AB4.1（Van Hartingsveldt等，1987）通过紫外线辐射得到的GA产生菌株（Mattern等，1992）。 具有suc1（呋喃果糖苷酶）基因的黑曲霉SKAn1015是通过转化（Zuccaro等人，2008）从黑曲霉AB1.13获得在组成型pkiA（丙酮酸激酶）启动子控制下产生的呋喃果糖苷酶。 类似地，衍生出在黑曲霉galA（GA）启动子控制下共表达GA和GFP基因的黑曲霉ANip7-MCS-gfp2。 galA启动子被木糖抑制，可被碳源（如葡萄糖或麦芽糖）诱导。所有的菌种以冷冻孢子悬浮液的形式用50％甘油保存在-80℃。

培养基

曲霉AB1.13培养基（1L）：20g D-葡萄糖，0.25g尿苷，50mL盐溶液（6.6g / L（NH4）2SO4,2.5g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO4·7H2O,0.1g/L CaCl2·H2O）和100 mL微量元素（5 mg/L柠檬酸水，5 mg/L ZnSO4·7H2O，1 mg/L Fe（NH4）2（SO4）2·6H2O，0.16 mg/L CuSO4，0.05mg/L H3BO3，0.05mg/L Na2MoO4→H2O和0.037mg/L MnSO4·2H 2 O）。黑曲霉SKAn1015培养基（1L）:20g D-葡萄糖,20mL盐溶液（6g/L NaNO3，0.5g/L KCl，1.5g/L KH2PO4，0.5g/L MgSO4·7H2O）和1mL微量元素溶液（10mg/L EDTA，4.4mg/L ZnSO4·7H2O，1.01mg/L MnCl2·4H2O，0.32mg/L CuSO4·5H2O，1mg/L FeSO4·7H2O，0.32mg/L CoCl2·6H2O，1.47mg/L CaCl2·2H2O和0.22mg/L（NH4）6Mo7O24·4H2O）。将葡萄糖、盐溶液和微量元素溶液分别在121℃高压灭菌20分钟，冷却至室温再混合使用。黑曲霉ANip7-MSC-gfp2培养基（1L）：10g D-木糖，50mL盐溶液（6.6g/L（NH4）2SO4，2.5g/L KH2PO4，0.2g/L MgSO4·7H2O和CaCl2·H2O）和100 mL微量元素（5 mg/L柠檬酸→H2O，5 mg/L ZnSO4·7H2O，1 mg/L Fe（NH4）2（SO4）2·6H2O，0.16mg /L CuSO4，0.05mg/L H3BO3，0.05mg/L Na2MoO4·2H2O和0.037mg/L MnSO4·2H2O）。培养40小时后，加入10g/L D-麦芽糖诱导GA产生。

微粒

从Sigma-Aldrich（Seelze，德国）得到不同尺寸（lt;10mm，325目，350目）的含水硅酸镁（3MgO·4SiO2·H2O，滑石粉）以及氧化铝微粒（氧化铝水合物，Al2O3，gt; 64％）干粉。 在使用之前，将微粒重悬于50mM乙酸钠缓冲液（pH6.5）中并在121℃高压灭菌20分钟。 随后，将微粒加入到无菌的最小生长培养基中。 在对照培养物（无颗粒）中，用50mM乙酸钠缓冲液（pH6.5）代替微粒悬浮液。根据总分布（Q）和密度分布（q），通过粒度分析（Helos，Hamburg，德国）确定三种不同组分的平均粒度直径（X50）。 结果总结在表I中。

表1 通过粒度分析估计的含水硅酸镁微粒和氧化铝（Sigma-Aldrich）的不同级分（350目，10mm，325目）的粒度分布。

培养

在有30g/L马铃薯葡萄糖琼脂（Sigma-Aldrich）和10g/L琼脂（Sigma-Aldrich）的琼脂平板上制备黑曲霉的孢子接种物。如果合适的话，在平板中加入1g/L尿苷。在30℃温育大约3天后，将每板孢子制悬浮于20mL 0.9％NaCl溶液中。过滤孢子悬浮液（miracloth，孔径25mm，德国法兰克福Calbiochem公司），除去琼脂残留物，保存在4℃备用。

在培养基中接种孢子悬浮液，使初始孢子浓度为每毫升1*10^ 6个孢子。生长温度为37plusmn;0.1℃（黑曲霉SKAn1015）和30plusmn;0.1℃（黑曲霉AB1.13和黑曲霉ANip7-MSC-gfp2）。生长在含有50mL培养基的250mL带挡板烧瓶中的黑曲霉培养物在旋转振荡器（Certomat BS-1/50mm，Sartorius，Gohtingen，德国）上以120plusmn;1rpm培养72小时。此外，用工作体积为2.2L的3.0L搅拌釜式生物反应器（Applikon，Schiedam，荷兰）培养黑曲霉AB1.13，用质量流量控制器（red-y compact，VogtlinInstruments，Hamburg，Germany）将通气速率保持恒定在1.00plusmn;0.02L/min，用两个六叶片圆盘涡轮叶轮（等于44W/m3的体积功率输入）将搅拌速度保持在200plusmn;1min-1，并监测废气中的氧气和二氧化碳水平（BC perFerm，BlueSens，Herten，德国）。必要时手动加入消泡剂（Ucolub N115，德国Muhlheim）。通过加入2M NaOH或2M HCl使pH自动保持恒定。

底物和产品分析

细胞浓度通过重量分析确定。将样品（10mL）用醋酸纤维素过滤器（孔径20mm，Sartorius）过滤。然后用去离子水洗涤两次，并在100℃下烘干至恒重。在干燥器中冷却后，通过重新称重测定细胞干重（g/L）。所有的数据是三组平行实验的平均值。在微粒培养中，生物量数据因为添加的颗粒而变化。将培养上清液中多元醇和有机酸以Metacarb 67H柱（250mmtimes;4.6mm，5mm，VWR-Hitachi International GmbH，Darmstadt，德国）和1mM H2SO4作为流动相，并在70℃和0.8mL/min下通过HPLC系统（Elite Lachrome HITACHI Ltd.，Japan）进行定量分析。多元醇（甘露醇，红霉素和甘油）和有机酸（甲酸盐，草酸盐，乙酸盐，丁酸盐和葡萄糖酸盐）的紫外吸收波长为210nm。使用葡萄糖分析仪（Biochemistry Analyze，YSI，Yellow Springs，OH）测定葡萄糖浓度。

酶学分析

用醋酸纤维素过滤器（孔径20mm，Sartorius）过滤10mL培养液，取上清培养液测定呋喃果糖苷酶的比活性。反应体系（220mL）包括200mu;L溶于0.05M磷酸盐缓冲液（pH5.4）的1.65M蔗糖和20mu;L样品。在20mu;L样品中加入200mu;L蔗糖后开始反应，在40℃温育20分钟。95℃加热10分钟停止反应。冷却后，将反应体系在4℃，13,000g离心10分钟。然后使用GOD / POD定量测定（Sigma-Aldrich）（Miller，1959）由酶切割蔗糖形成的葡萄糖。在目前的研究中，它用于96孔微量滴定板（MaxiSorp，Nunc，Langenselbold，德国）的高通量分析。在该测定中，通过将10.5mg葡萄糖氧化酶（GOD）和3mg过氧化物酶（POD）重悬于90mL 0.05M磷酸盐缓冲液（pH7.0）和10mL含有25mg邻苯二甲酸酐的95％乙醇中来制备酶试剂溶液。随后，将试剂溶液用醋酸纤维素过滤器（孔径20mm，Sartorius）过滤并立即用于测定。为此，将1.6mu;L样品与200mu;L试剂溶液在微量滴定板孔中混合。在40℃孵育10分钟后，用96孔Sunrise酶标仪（TECAN，Crailsheim，德国）和XFlour4数据检索软件。为了证明培养肉汤中残葡萄糖的残留，接种在95℃加热10分钟后、呋喃果糖苷酶失活的样品进行阴性对照。过滤（孔径20mm，Sartorius）10mL培养液，用10mM醋酸钠缓冲液（pH 4.5）洗两次后得到细胞提取物，然后将细胞悬浮在新配制的缓冲液中在研钵中研磨6分钟（RMO，Retsch，Haan，德国）并再次过滤（孔径为0.2mm，Sartorius），以对硝基苯基吡喃葡萄糖苷（pNPG）作为底物测量粗提取物中的GA活性（Withers等人，1978）。每500mL pNPG溶液（0.1％w/v，在乙酸钠缓冲液中，pH4.8）加入到250mL细胞提取物中，在60℃温育20分钟后，通过加入750mu;L 0.1M硼酸钠终止酶促反应。过滤后（0.2mm孔径，Sartorius）测量其在400nm处的吸收值，并进行三组平行实验。

显微镜图像分析

使用立体显微镜（Stemi 2000-C，ZEISS，Jena，德国）和AxioCamMRc5照相机（Stemi 2000-C，ZEISS）通过3D照片分析整个培养中的培养物形态学。

蛋白质生产的空间分辨率

共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）用于分析细胞聚集体内GFP荧光的空间分布

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