马铃薯WRKY转录因子基因家族的全基因组鉴定外文翻译资料

 2022-05-29 22:52:25

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马铃薯WRKY转录因子基因家族的全基因组鉴定

作者：Chao Zhang , Dongdong Wang , Chenghui Yang , Nana Kong, Zheng Shi, Peng Zhao, Yunyou Nan, Tengkun Nie, Ruoqiu Wang, Haoli Ma , Qin Chen

摘要

WRKY转录因子在调控胁迫反应中起关键作用。本研究在马铃薯（Solanum tuberosum）中鉴定了79个WRKY基因。根据多序列比对和系统发育关系，将WRKY基因主要分为三类。 其中，马铃薯中WRKY基因大部分属于第Ⅱ类（52个StWRKY），第Ⅲ类有14个，第Ⅰ类有13个。系统发育树进一步将第Ⅱ类分为五个亚类。除StWRKY79外，所有StWRKY基因均定位于马铃薯​​染色体上，其中8个串联重复基因对和7个来自StWRKY家族基因的节段性重复基因对。 在各种胁迫条件下，22个StWRKYs基因具有表达差异。顺式元件预测显示StWRKY基因启动子区存在大量响应干旱、热和水杨酸元件。基因表达分析显示，7个StWRKY对胁迫（热，干旱和盐度）和水杨酸处理有响应。这些基因可用于进一步研究非生物胁迫信号途径。

介绍

转录因子（TFs）参与基因转录调节网络，调节植物中的基因表达。 在植物基因组中，大量的基因编码转录因子。

因包含WRKY结构域而命名的WRKY 转录因子家族在许多生物体中广泛存在。WRKY结构域是一个由60个氨基酸组成的高度保守的序列，包含七肽WRKYGQK（还有WRKYGKK，WKKYGQK，WRKYGQR，WRKYGEK等形式）和一个C2H2或C2HC型锌指结构。根据WRKY结构域的数目和锌指结构的类型，WRKY家族可分为三大类。第Ⅰ类包含2个WRKY结构域，分别位于C端和N端。其他两类只有一个WRKY结构域。第Ⅰ类和第Ⅱ类含有C2H2型锌指结构，只有第Ⅲ类含有C2HC型锌指结构。在拟南芥中，第Ⅱ类基因可分为5个亚类：Ⅱ-a，Ⅱ-b，Ⅱ-c，Ⅱ-d，Ⅱ-e。

第一个WRKY转录因子SPF1，被称作DNA结合蛋白，从甘薯中克隆，并且其WRKY转录因子家族已经被鉴定。先前的研究鉴定出在拟南芥中至少含有72个WRKY家族基因，在杨树中大约有100个，在葡萄（Vitis vinifera ）中含有59个，在番茄（Solanum lycopersicum）中含有81个，在辣椒（Capsicum annuum）中含有71个。WRKY家族进化的先前研究显示，第Ⅰ类是一个祖先组。 第Ⅱ类和第Ⅲ类源于第Ⅰ类，缺乏N-末端WRKY结构域。

许多研究表明，WRKY基因家族成员与植物发育过程有关，如纤维发育和棉花叶片衰老。一些研究人员发现，WRKY基因家族成员与胚胎和花药的发育有关。它们在植物胁迫中同样发挥作用。WRKY基因可以抵抗细菌、真菌和病毒的感染，并对寒冷、盐渍、干旱和伤害产生抗性。Qin的研究表明11个OsWRKY基因对盐、干旱、寒冷和热胁迫产生响应。类似地，通过转基因拟南芥植物的几个GmWRKY基因来提高对这些胁迫的抗性。 WRKY基因在胁迫中的功能鉴定可以用于培育抗逆性增加的新品种。

关于马铃薯中WRKY家族的相关研究还很少。作为世界的一种普遍食品，尤其是在欧洲和美国，每年消耗很多马铃薯。为了满足需求，增加产量是非常重要的。植物微环境的研究显示生物和非生物胁迫是限制马铃薯产量的重要因素。然而，StWRKY1只被Yogendra和Shahzad研究过，还有一些与丛枝菌根马铃薯根定植相关的WRKY基因被发现。在2016年，Yogendra发现StWRKY8与枯萎病相关。作为一个胁迫相关的基因家族，应该研究利用它们提高抗逆性和适应性的可能性。这个研究旨在调查S. tuberosum中WRKY基因的信息和一些StWRKY基因在胁迫条件下的表达。

材料和方法

数据库序列搜索

马铃薯的蛋白质和基因序列从PGSC数据库中下载。拟南芥WRKY基因和番茄（S. lycopersicum）WRKY基因的位点编号从Eulgem 和Huang的文章中获取。WRKY蛋白质序列从TAIR和plantTFDB网站获取。

以AtWRKY和SlWRKY蛋白序列作为查询序列通过BLASTP来搜索马铃薯WRKY家族成员。为了获取精确的结果，E值被设定为10。然后利用NCBI-CDD网站分析保守序列并删除缺少WRKY注释的序列。Cluster X软件用来确认WRKYGQK保守域或相似序列的存在。

马铃薯WRKY基因在染色体上的定位

PGSC网站上有所有被鉴定的StWRKY基因的相关信息。MapChart2.30软件用来定位染色体上的基因座。根据Cheng的方法鉴定StWRKY基因的串联重复序列。在100kb内含有2至多个WRKY基因被视为串联重复。关于片段重复的信息来源于PGDD网站，通过Circos软件显示片段重复。

构建系统发育树和WRKY成员的分类

为了构建StWRKY系统发育树并将其分类需要一些其他植物WRKY蛋白的信息。拟南芥（Arabidopsis），辣椒（C. annuum）和番茄（S. lycopersicum）WRKY蛋白是从其他研究中获得的。用Clustal X软件评估所有这些蛋白质序列，并进行完全比对。 然后，使用MEGA6.0软件，通过测试邻接树方法构建的系统发生树。 使用DNAMAN软件分析序列比对并鉴定StWRKY。

WRKY成员的结构

利用GSDS2.0网站检测马铃薯WRKY基因的外显子-内含子结构。通过MEME网站分析基序，每个成员总共搜索了20个基序。

植物生长条件和处理

马铃薯材料为经过测序的双单倍体品种，DM1-3-516-R44。将无病毒的幼苗放在含有维生素培养基的MS固体基础培养基中,放在25plusmn;1℃的植物培养箱中，在10,000Lx光照16h，黑暗8h条件下培养4周。然后将幼苗转移到MS液体培养基中。

马铃薯中潜在的与热、干旱和盐相关的WRKY基因已经被鉴定。加入150mM NaCl进行处理，加入260mM甘露醇进行干旱处理。 将幼苗维持在35℃进行热处理。对于生物胁迫，水杨酸喷洒到在温室生长4周的马铃薯叶子表面。将处理过的植物放在含有SA的湿滤纸的培养皿中。所有处理材料均在3和24h时收集。

实时定量PCR分析

收集处理3h和24h的植物幼苗，用植物RNA纯化试剂从不同处理样品中分离总RNA，并用PrimeScript试剂盒合成cDNA。通常情况，将cDNA的终浓度稀释5倍使用。利用Primer Premier 5 软件设计用于实时定量PCR的基因特异性引物。Bio-Rad公司实时定量PCR分析系统基于三个技术重复进行分析。利用延长因子1-a（ef1a）将来自不同处理的基因的表达水平进行归一化。利用Haoli Ma的方法分析相对表达水平。

StWRKY基因的顺式元件分析

在Phytozome 12网站上搜索22个StWRKY的基因上游序列（大约1500bp），在plantCARE网站上获取顺式元件。主要涉及ABRE（参与脱落酸反应的顺式作用元件），HSE（参与热应激反应的顺式作用元件），MBS（参与干旱诱导的MYB结合位点），TC-rich repeats（参与防御和胁迫反应的作用元件），TCA元件（涉及水杨酸反应的顺式作用元件）和W-box（WRKY结合位点）。

结果

StWRKY家族基因的鉴定

为了鉴定马铃薯中的WRKY转录因子基因，利用非冗余蛋白质通过BLASTP检索来鉴定WRKY家族成员。总共有761个和拟南芥WRKY基因高度相似的不同序列，147个和番茄WRKY基因高度相似的不同序列。以下为NCBI-CDD网站的分析，129个序列被认定为WRKY成员。但是，这个结果包含有非代表性的序列。 此外，WRKY家族成员应含有一个保守的七肽，但序列比对显示一些序列没有WRKYGQK或WRKYGQK样的保守结构域。对全长蛋白质序列进行Clustal X分析，获得了79个不同序列及相关信息（表1）。虽然WRKYGQK基序是一个高度保守结构域，但12个基因还是在氨基酸中存在一部分变化（表1）。

表1.马铃薯中WRKY基因的鉴定

StWRKY蛋白质的平均长度为338个aa，范围在102个aa（StWRKY79）和748个aa（StWRKY52）之间。表1给出了基因位点编号、染色体定位、WRKYGQK保守七肽、锌指基序类型、WRKY结构域的数目、等电点、分子量和外显子的数目。

StWRKY成员的染色体定位和基因重复的分析

Mapchart软件用来检测基因在每个染色体上的位置。根据基因在染色体上的位置，这些WRKY基因被命名为WRKY1到WRKY79。这个图谱显示出染色体除StWRKY79外包含所有StWRKY基因。2个较短的染色体，2号染色体（48.61Mb）和5号染色体（52.07Mb）分别含有10个基因。9号染色体上只有3个基因。没有WRKY基因定位在11号染色体上。在一些染色体上基因紧密排列。

图1. StWRKY成员在马铃薯染色体上的位置及基因重复分析。（A）StWRKY成员在马铃薯染色体上的位置和串联重复。 蓝色框表示这些成员是串联重复。 StWRKY79不位于任何染色体中。（B）关于StWRKY成员的节段式重复基因。不同的颜色块表示马铃薯染色体的部分。染色体上相同颜色的粗线表示串联重复，细线连接节段性重复基因对，不同颜色表示不同重复。

串联重复的基因是基于Cheng的方法，这些紧密的基因被称为簇。StWRKY基因在3号、5号、8号和12号染色体上形成簇。蓝色方框显示出总共8个簇（17个基因）（图 1A）。从PGSC网站上下载的数据库的研究显示来自StWRKY基因的七部分是节段式重复基因（15个基因）（图1B），这些节段式重复基因分布在7条染色体上。

系统发育分析和StWRKY基因分类

WRKY家族的定义特征是WRKYGQK结构域和锌指结构。然而，不同组拥有它们的特定组件。WRKY结构域和锌指类型的详细结构可以通过多序列比对显示（图2）。总共13个基因包含2个WRKYGQK结构域被分为同一类，然而锌指结构有细微的差别，一个是CX4CX22HXH和另一个是CX4CX23HXH。七肽WRKYGQK分别位于C-和N-末端。因此，即使它们在同一个基因中，第Ⅰ类也可以分离成I-C和I-N。另一部分可以通过14个基因构建，这些基因可以轻易通过特殊锌指结构CX7CX24HXC 的存在而区分。剩余基因（52个基因）形成最后一部分，一个大的基因含有一个WRKY结构域和一个相邻的CX5CX23HXH锌指结构。有趣的是，四个不包含整个锌指基序结构的StWRKY也属于WRKY家族。

图2. 79个StWRKY蛋白质序列的比较。使用DNAMAN软件进行排列。N或C分别表示N端和C端。黄色框内为锌指基序和WRKY结构域。星号表示主要的保守序列。

为了获得详细的分类，四种植物WRKY成员被用来构建进化树：来自拟南芥（A. thaliana）的54个WRKY蛋白，来自辣椒（C. annuum）的53个WRKY蛋白，来自番茄（S. lycopersicum）的77个WRKY蛋白和来自马铃薯（S. tuberosum）的79个蛋白（图3）。下面是其他分类，第Ⅱ类被分为5个亚类：Ⅱ-a（5个成员），Ⅱ-b（6个成员），Ⅱ-c（18个成员），Ⅱ-d（7个成员）和Ⅱ-e（16个成员）。II-a和II-b以及II-d和II-e分别聚集在一个分支中。这个分类与其他高等植物相同，特别是在双子叶植物中。

图3. 4种植物WRKY蛋白的系统发育树。利用邻接法构建树，包含拟南芥，辣椒，番茄和马铃薯总共261个蛋白质序列。 不同的区域代表不同的类别。

StWRKY基因家族的结构

为了

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