砷暴露对小鼠肠道微生物群落及其代谢谱的影响：综合宏基因组学和代谢组学分析外文翻译资料

 2022-06-07 21:42:45

英语原文共 8 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

砷暴露对小鼠肠道微生物群落及其代谢谱的影响：综合宏基因组学和代谢组学分析

背景：人体肠道是一个极其复杂，多样化和广泛的微生物群落 - 肠道微生物群。肠道微生物组在代谢加工，能量产生，免疫和认知发育，上皮细胞稳态等方面起着深远的作用。然而，肠道微生物组的组成和多样性容易受到外部因素的影响，这提高了接触对有毒的环境化学品导致肠道微生物组改变或生态失调的可能性。砷接触影响全球大量人口，并与许多疾病有关，包括癌症，糖尿病和心血管疾病。

目标：我们调查了砷暴露对肠道微生物组成及其代谢特征的影响。
方法：我们采用综合方法，结合16S rRNA基因测序和基于质谱的代谢组学分析来检查砷暴露对肠道微生物群的功能影响。
结果：16S rRNA基因测序揭示，在饮用水中暴露于10ppm砷4周后，砷显着干扰C57BL / 6小鼠的肠道微生物组成。此外，代谢组学分析揭示了并发效应，许多肠道微生物相关代谢物在多种生物基质中受到扰动。
结论：砷暴露不仅会改变肠道微生物群落的丰度水平，而且还会在功能水平上大幅干扰其代谢特征。这些发现可能提供关于肠道微生物组扰乱的新见解及其作为砷暴露导致或加剧人类疾病的潜在新机制的功能。

介绍
人体内容纳100万亿肠道微生物，约比所有人类细胞高出10倍（Ley et al。2006）。 Ley等人（2006）估计，居住在人类肠道中的大约500-1,000个物种编码比人类基因组多100倍的独特基因。肠道微生物群在代谢过程，能量产生，免疫细胞发育，食物消化，上皮细胞稳态等方面具有重要功能（Young et al.2008）。越来越多的证据表明，失调的肠道微生物区系以显着的方式促成各种疾病，包括糖尿病，肥胖症，心血管疾病，变态反应，炎症性肠病等（Ley et al.2005; Qin et al。2012; Wang等2011）。例如，与瘦个体相比，肥胖个体表现出拟杆菌丰富度的显着降低和厚壁菌相对增加（Turnbaugh等，2006）。同样，宏基因组范围内的关联研究显示，有益的丁酸生产细菌较少，而且糖尿病患者的机会性病原体比健康人更多（Qin et al。2012）。肠道微生物组在生命的最初几年中经历几次转变，并且如果没有显着的干扰发生，则其保持相对恒定。然而，肠道微生物组的组成是高度多样化的，并且这种多样性可以容易地受到诸如环境，饮食，细菌/病毒感染和抗生素的外部因素的影响。这提高了暴露于有毒环境化学品导致肠道微生物组改变（生态失调）作为环境因素对人体健康产生不利影响的机制的可能性。

砷暴露影响全球大量人口，由无机砷的地质来源污染饮用水是主要的发展途径。全世界有数亿人，尤其是南亚和东亚的人们饮用含砷量远高于世界卫生组织和美国环境保护局（EPA）制定或接受的10mu;g/ L指南（Hughes et al 2011）。在美国，估计有多达2500万人饮用含砷量gt; 10mu;g/ L的水，因为美国环保局和其他机构并未监管私人水井（Kozul et al。2009）。砷暴露与许多疾病有关，如皮肤，膀胱癌，肺癌，肝癌和糖尿病以及心血管疾病（Hughes et al。2011; Van de Wiele et al。2010）。最近，砷暴露与动物模型和人群研究中糖尿病发病率的增加有关（Paul et al。2011）。已经提出了许多对砷诱导的疾病的机制，包括砷和硫之间的相互作用，氧化应激，基因毒性，改变的DNA修复和信号转导，细胞增殖和表观遗传学（Hou et al。2012; Hughes et al。 2011; Ren等2011; Smeester等2011）。越来越多的证据表明肠道微生物组的扰动及其对代谢和生理功能的影响可能在人类疾病的发展中起重要作用。鉴于肠道微生物组在人体健康的多个方面的重要作用以及砷的高毒性，有必要阐明砷暴露对肠道微生物群及其功能的影响。尤其是，一些开创性研究报道了肠道微生物组与环境化学物质如砷，汞，多环芳烃和多氯联苯之间的相互作用（Choi等2013; Liebert等1997; Pinyayev等2011; Van de Wiele等2005，2010）。
肠道微生物群在调节宿主代谢方面具有深刻的作用。例如，消化不良的碳水化合物通过肠道细菌发酵而降解，产生微生物生长所需的能量和作为能量底物，炎症调节剂和信号分子的微生物末端产物（Holmes et al。2011）。因此，肠道微生物对宿主新陈代谢的影响远远超过肠道对局部各种器官系统如肝，脑，脂肪和肌肉的局部影响（Claus et al。2011; Diaz et al。2011）。越来越多的证据表明，与肠道微生物组成变化相关的代谢紊乱是发展中疾病的重要危险因素（Jones et al.2008; Wang et al。2011）。例如，肠道菌群产生的膳食胆碱和肉毒碱产生的三甲胺N-氧化物在动物模型和临床队列中与动脉粥样硬化密切相关（Wang et al。2011）。因此，探讨与砷干扰肠道微生物群落相关的肠道微生物组相关代谢变化特别令人感兴趣。在这方面，基于质谱的代谢组学分析具有很高的灵敏度，能够检测具有不同结构的分子，具有宽动态范围，定量能力和易于与其他分离技术如液相色谱（Lu等，2012）。
在本研究中，我们应用了一种结合16S rRNA基因测序和液相色谱 - 质谱（LC-MS）代谢组学的综合方法来分析砷暴露对肠道微生物组及其代谢物谱的影响。宏基因组测序显示砷暴露显着干扰了C57BL / 6小鼠的肠道微生物组成。我们的非靶向代谢组学分析揭示了这些小鼠中砷暴露的显着影响，其中不同扰动的代谢物与肠道微生物组变化相关。

材料和方法
动物和暴露。无特定病原体的C57BL / 6雌性小鼠（约6周龄）购自Jackson Laboratories（Bar Harbor，ME）。向小鼠提供球状啮齿动物饮食（ProLab 3000; Purina Mills，Grey Summit，MO）和随意过滤的水并且维持在由国际实验动物护理评估和鉴定协会认可的设施中。在环境条件为22°C，40°C条件下，将20只小鼠（10只小鼠/组，体重= 20plusmn;3g）饲养在经热处理的硬木垫层上的静态微隔离笼（5只小鼠/笼） 70％湿度，12:12小时光照：黑暗循环。所有实验均由麻省理工学院动物护理委员会批准。对动物进行人道对待并考虑减轻痛苦。将无机砷（砷，10ppm）作为亚砷酸钠（Fisher Scientific，Waltham，MA）在饮用水中施用至小鼠（〜8周龄）4周。每周一和周四向小鼠提供新鲜制备的含砷水（10ppm）。对照组小鼠单独接受水。

动物监测和组织学分析。在整个实验中，每天评估小鼠的腹泻，脱水和身体状况恶化的证据。小鼠用二氧化碳安乐死并在4周砷消耗后尸检。常规处理福尔马林固定的组织，包埋在石蜡中，切成4mu;m，用苏木精和伊红染色，并且由不知道样品身份的经认证的兽医病理学家评估。以上升刻度对肝脏多个区域（左侧，内侧，右侧和尾状叶）和结肠（远端，横向和前肠结肠）的炎症，水肿，上皮缺陷，增生和发育不良进行评分（0-4，0是正常的）病变的严重程度和侵袭性（如果有的话）。病理学评分在对照组和砷处理组小鼠之间没有显示出任何显着差异，这里没有提供。我们也没有观察到体重，死亡率和食物摄入量的任何显着变化。

16S rRNA基因测序。 我们根据制造商的说明使用PowerSoilreg;DNA分离试剂盒（MO BIO Laboratories，Carlsbad，CA）在尸体解剖过程中收集粪便颗粒中的DNA。 通过紫外光谱定量所得的DNA并储存在-80°C用于进一步分析。 使用通用引物U515（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和E786（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）扩增DNA以靶向细菌的16S rRNA的V4区域。 对各个样品进行条形码化，合并以构建测序文库，然后使用Illumina Miseq（Illumina，San Diego，CA）进行测序以产生双末端150x150读数。

16S rRNA测序数据的分析。将原始配偶配对的fastq文件进行质量过滤，解复用，并使用定量洞察纳入微生物生态学（QIIME）软件（http://qiime.org）进行分析。对于质量过滤，QIIME的默认参数是主要的，其中包含最小Phred质量分数lt;20，包含不明确的碱基调用和lt;113bp的连续高质量碱基调用的读取被丢弃。此外，三个连续的低质量基地的阅读被截断。使用8-bp条形码将测序的样品解多重复，从而在条形码中允许1.5个错误。使用UCLUST软件（http://www.drive5.com/uclust）选择具有97％序列相似性阈值的操作分类单元（OTU）。使用核糖体数据库项目（RDP）分类器（http：//rdp.cme.msu.edu）选择来自每个OTU的代表性的一组序列用于每个OTU的分类学鉴定。使用Greengenes OTUs（4feb2011 build）参考序列（97％序列相似性）作为RDP分类器的训练序列。 0.80置信度阈值用于分类分配。 16S rRNA测序数据的分类分配可以在不同层次上实现，包括门，类，次序，家族和属。我们的分析通常是在家庭层面进行的，因为基于序列读取的分类群的分配具有更高的置信度;因此，家庭层面的显着变化可能反映了属种和物种水平上多种肠道细菌的变化。测序数据已经存储在MG-RAST（宏基因组学快速注释使用子系统技术）服务器（http：//metalnomics.anl.gov/）中。

代谢组学的样品处理。在小鼠安乐死之前一天，我们使用带有置于尿液收集容器周围的干冰的代谢笼收集尿液样本，以防止收集期（约16小时）期间代谢物的氧化或降解。粪便颗粒也从个体动物收集。我们在尸检期间收集血浆样本。如前所述，代谢产物使用甲醇从尿液中分离出来（Lu et al。2012）。向20mu;L尿或血浆中加入冷甲醇（80mu;L）。涡旋1分钟后，将样品在4℃温育20分钟，然后以12,000rpm离心10分钟。收集上清液，在SpeedVac（Savant SC110A; Thermo Electron，Waltham，MA）中干燥，然后重悬于30mu;L98：2水：乙腈中用于MS分析。代谢物从粪便中以类似的方式提取。将粪粒（25mg）溶于400mu;L冷甲醇溶液（50:50甲醇：水）中，随后使用平床旋涡（MO BIO Laboratories）以最大速度涡旋10分钟。将上清液以12,000rpm离心10分钟，在SpeedVac中干燥，然后重悬于30mu;L98：2水：乙腈中用于代谢组学分析。

代谢组学分析。 我们利用电喷雾电离源在四极杆飞行时间（Q-TOF）6510质谱仪（Agilent Technologies，Santa Clara，CA）上进行LC-MS分析。 质谱仪与Agilent 1200 HPLC系统连接。 Q-TOF每天使用安捷伦科技公司的标准调谐解决方案进行校准。 Q-TOF的典型质量准确度lt;10 ppm。 由于检测到的分子特征（即代谢物）数量较多，使用来自沃特世公司（Milford，MA）的C18T3反相色谱柱仅在80-1000m / z的范围内以正模式分析代谢物， 之前显示（Lu等，2012）。 代谢组学分析数据按前面所述进行处理（Lu et al。2012）。 在Q-TOF上产生MS / MS以确认扰动代谢物的身份。 代谢组学数据被提交到XCMS Online服务器（https：// xcmsonline.scripps.edu/）。

代谢组学数据的数据处理。采用安捷伦科技公司的MassHunter工作站软件将Agilent .d格式采集的数据转换为mzXML。数据按强度过滤，只考虑强度gt; 1,000的信号。使用XCMS Online对转换后的数据进行处理，以进行峰值采集，对齐，积分和提取峰强度。为了描述对照组和砷治疗组之间的个体代谢物差异，使用了双尾韦尔奇氏t检验（p lt;0.05）。根据人类代谢组数据库（HMDB; http：//www.hmdb.ca/），METLIN（http：// metlin.scripps.edu）和Kyoto Encyclopedia of Genes和具有10 ppm质量准确度阈值的Genomes（KEGG）数据库（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）。存储匹配的确切质量并用于产生MS / MS数据以鉴定代谢物。
数据统计分析。进行主要组分分析（PCA）以检查代谢组学数据的内在簇。使用95％置信区间（CI）作为阈值来识别所有样本中的潜在异常值。另外，使用分层聚类算法来生成热图以显现数据集内的代谢物差异。使用主坐标分析（PCoA）来比较对照和治疗之间的肠道微生物组文库。如先前所述（White等，2009），使用Metastats软件（http：// metastats.cbcb.umd.edu/）的非参数检验进一步评估肠道微生物组成的差异。使用Pearson相关系数生成肠道微生物相关代谢物和肠道细菌物种之间的相关矩阵。

结果
探索肠道微生物组功能变化的工作流程。实验工作流程将16S rRNA基因测序和代谢物分析相结合，以检查砷暴露对肠道微生物群及其代谢谱的影响（见补充材料，图S1）。简而言之，从粪便颗粒中分离DNA，使用16S rRNA特异性引物通过聚合酶链式反应扩增，然后使用Illumina Miseq平台通过150times;150bp配对末端测序进行扩增。结果
使用QIIME和Metastats软件包处理测序读数以揭示暴露诱导的肠道微生物组变化。对于代谢组学分析，粪便颗粒，尿液和血浆中的代谢物被提取并通过Q-TOF分析。进一步处理分子特征（即与给定分析物相关的所有信号）并用XCMS软件进行

全文共13602字，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[11212]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word

原文和译文剩余内容已隐藏，您需要先支付 30元 才能查看原文和译文全部内容！立即支付

以上是毕业论文外文翻译，课题毕业论文、任务书、文献综述、开题报告、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。

您可能感兴趣的文章