研究文章的总结 介绍：控制生物系统中功能部件的空间排列是合成生物学的一个重要目标外文翻译资料

 2022-06-12 21:10:59

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研究文章的总结

介绍：控制生物系统中功能部件的空间排列是合成生物学的一个重要目标。

实现这一目标可以产生新的研究工具，为在卫生和生物技术领域的有趣应用铺平道路。

DNA“折纸”可以通过将单链DNA“支架”用一组“钉”寡核苷酸折叠成自定义形状，从而在理想的尺度上构造任意形状，但单链DNA通常在活细胞中是不可用的，而且这种结构通常只在非生理温度下聚集。

到目前为止，由DNA本身所能完成的功能范围仍然有限。

另一方面，蛋白质提供了大量的功能，并且通过基因编码很容易在细胞中获得，但是从蛋白质中设计更大的结构框架仍然具有挑战性。

原理：在这里，我们重新构想了DNA“折纸”，以探究利用一组设计的蛋白质将双链DNA模板折叠成用户定义的DNA-蛋白质杂交物的可能性，在10-100纳米尺度大小。

为了实现我们的想法，我们需要合成DNA“缠绕”蛋白质，这样可以连接两个自定义的双螺旋DNA序列，我们需要确定合适的规则，以便在更大的目标结构的背景下，将模板和多个这种钉蛋白质排列在一起。

转录激活因子类似物（TAL）效应蛋白是由植物病原细菌产生的，并被注入宿主细胞，在那里它们与特定的启动子区域结合，从而控制目的基因的表达。

对一个TAL效应物的DNA识别部分由一组重复的子单元组成，它与双螺旋DNA的大沟相连，从而形成一个超级螺旋。

每个重复的子单元由34个氨基酸组成，并识别一个DNA碱基对。

由于其模块化的结构，TAL效应物可以被设计成与用户定义的DNA序列结合，而这项技术目前正被用于基因组工程应用。

为了对钉蛋白质进行结构调整，我们选择了TAL效应器的DNA识别域。

结果：我们将TAL效应物的DNA识别域描述为具有结合亲和性和序列特异性的特征。

为了构造钉的蛋白质，我们通过一个自定义的肽链将两个TAL蛋白质融合在一起，并测试了连接两个不同的双螺旋DNA结构域的能力。

为了创建包含多个钉蛋白连接的更大的对象，我们确定了一系列关于这些连接之间的最佳间隔的规则。

在这些规则的基础上，我们可以创建mDa规模的对象，实现各种结构主题，例如自定义曲率、顶点和角。

每一件对象都是由12个双联钉蛋白和一个带有设计的序列的模板DNA双链组成的。

我们增强了刚性还测试了多层结构的设计原则。

我们的纳米结构的所有组成部分都可以在接近生理的缓冲条件下，在室温条件下进行基因编码和自组装。

在这项工作中使用的钉蛋白质也携带了一个绿色荧光蛋白域，它可以作为各种功能蛋白质结构域的占位符，这些蛋白质结构域可以在基因上融合到钉蛋白质中。

我们还能够证明我们的结构的形成，从基因表达开始，在一个一步反应混合物中，包含双链DNA支架，编码钉蛋白质的基因，RNA聚合酶，核糖体，以及转录和翻译的辅因子。

利用透射电子显微镜，证实了我们的杂交纳米结构的成功自我组装。

结论：利用我们对折叠模板DNA双链的双联钉蛋白的系统，研究人员可以用自定义几何图形控制蛋白质域的空间排列。

我们的系统应该能很好地在细胞内工作，鉴于到我们的体外实验实验的成功，并且考虑到TAL的DNA结合特性在细胞内是保留的，就像在基于TAL的基因编辑实验中所看到的那样。

因为基于TAL的钉蛋白质可以特异性识别到任何所需的DNA序列,这些蛋白质可以被用来以基因组DNA创建自定义结构和环结，以研究基因组架构和基因表达之间的关系,或者以用户定义的方式定位参与细胞内过程的蛋白。

研究文章

我们描述了一种自下而上的制造方法，它允许将蛋白质的功能多样性整合到设计的三维结构框架中。

一套基于转录激活因子类似的效应蛋白的定制钉蛋白，将双链DNA模板折叠成一个用户定义的形状。

每一个钉蛋白质都被设计用来在模板上的不同位置，识别并紧密地连接两个不同的双螺旋DNA序列。

我们提出了构建兆道尔顿规模的DNA-蛋白质杂交形状的设计规则;

引入各种结构主题，如自定义曲率、角和顶点;

并描述了用增强的刚性来创造多层DNA-蛋白的原理。

我们证明了我们的杂交纳米结构在一锅混合物中的自我组装，包括设计蛋白质的遗传信息，模板DNA，RNA聚合酶，核糖体，以及转录和翻译的辅因子。

为了控制多功能性的空间排列，在10-100纳米尺度上设计基因编码的支架结构对于合成生物学和生物-纳米技术来说是一个重要的未被满足的挑战。

这些对象将会引起基础研究、医药和工业生物技术的兴趣。

例如,控制细胞内分子的空间排列可以帮助研究人员在多个尺度上探索空间秩序和功能,特别是在基因调控的背景下,(1)和信号传递下(2、3)。临床上活跃的，在逻辑上与细胞过程有关的自组装组件是可预见的。

为多个酶做支架进入一个共同的三维(3 d)框架还可以更有效地促进生产所需的化合物在基因工程细胞或细胞提取物(4)。自然以及设计的蛋白质提供了一个巨大的功能模块图书馆，为分子识别和酶催化(5 - 8)而且蛋白质还能作为形成高阶的组件中心(9、10)。

另一方面，DNA纳米技术（11）提供了构造任意形状（12——17）、周期阵列（18——21）和机制（22——24）的可能性，其整体或重复的单位尺寸从几十到数百纳米不等。

将基于蛋白质的功能集成到设计的基于DNA的结构支架中，可以为创建具有用户定义形状的多功能装配（25——28）提供一种有吸引力的方法。

然而，尽管蛋白质可以很容易地在体内进行基因编码和生产，但在细胞内复杂的DNA结构的编码和组装面临着巨大的障碍。

例如，DNA纳米结构通常不能在没有事先退火的情况下进行折叠（29），而且这些物体从DNA单链中组装而成，在活细胞中不易获得。

基于RNA设计的纳米结构可以有潜力通过共转录折叠（30）在细胞内组装;

然而，目前还不清楚如何将额外的功能整合到这些RNA支架中。

设计钉蛋白

设计的钉蛋白质

我们从DNA纳米技术中重新构想了DNA“折纸设计原则”（12）。

与DNA“折纸”不同的是，我们的方法使用的是双螺旋DNA和蛋白质。

在我们的方法中，一个具有自定义长度的连续双螺旋DNA模板，假设一个支架的作用是由一组设计的钉蛋白所组成的，将其折叠成一个用户定义的3D排列; （图1A

另见图1）（31）。

每一种钉的蛋白质都是专门用来识别两种不同的双螺旋DNA序列的，在双螺旋DNA模板上有用户定义的分离。

钉的蛋白质可以携带额外的功能。

灵感来自于反平行的连接中常用的DNA纳米技术(32),我们设想的使用钉蛋白质,它们形成一个反平行的交叉连接两个平行的DNA双股链(图1)。构建钉蛋白质,我们依赖于识别功能为双螺旋DNA转录激活因子类似物 (TAL)效应蛋白(33-36)。

由于它们的重复结构，TAL效应物提供了一种可编程性，使大量的钉蛋白质能够针对任何想要的DNA序列。

在钉蛋白质中，每个DNA识别部分由一个包含100个氨基酸的n终端域组成，还有20个标准的重复序列，其中每一个重复包含34个氨基酸（图1B，顶部inset）。

n终端域识别一个TA DNA碱基对，而每一个规范的TAL重复识别一个用户定义的DNA碱基对。

因此，被我们的每一半钉蛋白质的识别的结合序列就是21个碱基对（bp）长。

将包含n-端域和21-bp结合序列的选择是设计在简单性（21 bp对应于两个完整的标准b型DNA）和来自生物物理亲和性和序列特异性研究的上的。

S2和S3)。

例如，使用绿色荧光蛋白（GFP）——TAL融合蛋白和氰胺3——标记的模板DNA的整体荧光共振能量传输（FRET）测量表明了纳米系统中的双分子离解常数（图2）。

为了测试TAL蛋白的序列特异性，我们进行了基于凝胶迁移竞争分析，揭示了一个有20个重复序列的TAL蛋白质在有竞争的非目标DNA（图3）的情况下，忠实地识别出它正确的序列目标。

在某些情况下，TAL蛋白甚至能够区分出一个错配的碱基对。

我们注意到，其他研究人员也报告了类似的特异性和选择性测试，目的是为基因组编辑（37，38）创造改进的TAL-效应核酶（TALENs）。

为了构造一种可以在单张开放阅读框架中进行基因编码的双联钉蛋白，我们将一个DNA识别的C端与另一个TAL的N端（图1B，顶部inset）联系在一起。

由于没有足够详细的关于n-端TAL域的结构信息和c-端子出口点的性质，我们必须设计和实验测试几种不同的候选肽链序列（图，S4A）。

在大肠杆菌、溶解度和连接两个独立的DNA双链（图，S4B）的能力的基础上，我们从11个候选序列中选择了一个链接序列，并在所有的钉蛋白质中使用了这个链接器。

我们还把一个GFP的域融合到双联钉蛋白的N端。

GFP的荧光促进了净化和分析，同时也充当了另一个具有自定义功能的蛋白质领域的占位符。

说明double-TAL钉蛋白质的形状构造和绑定到两个模板DNA双螺旋域,我们创建了一个结构模型组成的两个反平行的DNA-bound TAL分子(34)和电子密度计算预测从不同的方向(图1,C和D)。状态预测与实验吻合良好实现反平行的staple-protein连接的环境中更大的DNA蛋白质混合结构在电子显微镜观察实验(图1,C和D)。

节间距规则

在建立了基本的双TAL主食蛋白后，我们着手确定了一套设计规则，用于创建基于多重双链钉蛋白和一个长长的双螺旋DNA模板的更复杂的结构框架。

创建如此多的com-复杂对象的必要步骤是能够通过多种钉蛋白质连接两个平行螺旋体。

由于b型DNA的螺旋性，在相同的螺旋结构中，将一个结合位点相对于另一个结合在一起，会导致一个钉蛋白质结的旋转相对于另一个。

因此，要获得平面性，重要的是在每个DNA螺旋上找到两个结合位点的适当的相对位置，这将在结合位点（图1B，右下方）之间的双螺旋间隔的长度上。

因为TAL蛋白的结合序列可以包含在DNA双螺旋域的两股中，所以TAL蛋白质可以在不同的方向结合。

相邻的两种钉蛋白质的相对方向将影响相邻结合位点之间合适的间距的选择。

总的来说，两个相邻的钉蛋白有6个独特的相对方位（图2，A到D）。在DNA纳米技术中，结间距规则来源于b型DNA的几何形状（12、14、32）。

在这里，我们无法获得钉蛋白质连接的详细几何性质。

对于相邻的TAL蛋白具有相同取向的配置（图2A），通过简单地将结合位点间隔为单个b型DNA螺旋旋转的整数倍，就可以实现平面性。

对于其他五种可能的配置，我们必须根据经验来确定连接间隔规则。

在一组测试结构的TEM成像（见图5）的基础上，我们得出了图2所示的间隔规则。

图2A中的双交叉主题在相同的方向上有两种钉的蛋白质。

从结果结构中获得的图像类似于来自图1D的反平行交叉图案的两份拷贝，显示了顶部DNA双链上的mm-形状的sig。

相比之下，图2B的主题是相反方向的两种钉蛋白质。

方向上的变化反映在产生的图像上，现在显示在顶部的DNA双链上有一个mw形的签名。

基于间隔长度，我们再次构造了结构模型和计算电子密度投影（图2、A和B），这些投影与实验图像数据吻合较好，并再现了不同方向的数据之间的细微差别。

图2 A到D的结间距规则允许构建更大的DNA-蛋白质混合纳米结构，这可以通过组合多个双交叉的图案来实现，例如，具有相同方向的钉蛋白质之间的距离是与21个bp的整数倍相对应的距离。

例如，图2A中的配置可以简单地沿着螺旋方向重复，形成一个丝状的双螺旋束。

或者，图2B中的配置可以通过交替间隔长度（图2E）来达到同样的目的。

为了观察某些构型是否比其他构型更适合于制造更大的混合对象，我们用一组12种不同的钉蛋白质构造了四个截然不同的双螺旋束。

对于每一个双螺旋包变体，我们设计了一个定制的DNA模板序列，其中包含24个唯一的识别位点。

我们发现，在图2、A和D中重复使用双交叉图案的两个螺旋束，倾向于形成多链的高阶结构，而基于图2、B和C的图案的束则钉是monomeric（图6）。

我们推测，TAL蛋白表面特征的高度重复的模式可以促进蛋白质-蛋白质相互作用的致冷效应。

这种效应强烈增强当所有结合位点在DNA双螺旋结构指向同一个方向,一样的双交叉图案在图2中,A和d .因此,尽量减少不受欢迎的重复互动主题,为进一步设计我们使用交替钉蛋白质取向从图2,B和c,说明该网站的选择性钉蛋白质,我们孵化中使用的模板DNA two-helix包图2 e所示不同子集的12个钉蛋白质。

从产生的物体中获得的TEM数据揭示了预期模式中钉蛋白质的结合（图2、F和G）。

结构主题

在建立了基本的设计规则之后，我们探索了创建结构模块的可能性，例如自定义曲率、拐角和顶点。

我们设计了一系列的模板DNA序列，这些序列可以被同一组12种钉蛋白质折叠成不同的形状。

我们设计了一个180弧，一个开放的圆，一个闭合的环，一个三臂的恒星，一个Drigalski抹刀，一个正方形，一个四臂交叉，很可能会采用一个三维四面体的形状（图3）。每个物体的成像都证实了成功的组装成设计的形状。

弯曲的结构（图3，A到C）证明了钉的蛋白质可以承受机械负荷。

封闭的环和方形物体（图3、C和F）比开放的物体更均匀，

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