来源于滇池水华束丝藻的麻痹性贝类毒素对斑马鱼的神经毒性外文翻译资料

 2022-06-14 21:52:31

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摘要：水华束丝藻是一种在世界淡水水体中经常遇到的蓝细菌，也是淡水中神经毒性麻痹性贝类毒素(PSP)主要的来源，这些神经毒素将对人类环境和人体健康构成重大威胁。尽管PSP作用的分子机制已经清楚，然而许多与其毒性机制有关的问题仍然需要解决。本文通过高效液相色谱（HPLC）分析得知，从滇池水华束丝藻中提取的束丝藻毒素的主要成分是膝沟藻毒素1（GTX1），膝沟藻毒素5（GTX5）（分别占34.04％和21.28％）和新石房蛤毒素（12.77％）。利用毒素对斑马鱼进行腹腔注射处理后，我们研究得到束丝藻毒素的半数致死量（LD 50）为11.33mu;g / kg（7.75mu;g石房蛤毒素等价物STXeq/ kg）（Danio rerio）。为了研究并揭示束丝藻毒素的神经毒理学，本文将从滇池水华束丝藻提取纯化的束丝藻毒素，按照含7.73和9.28mu;g/ kg（分别相当于5.3和6.4mu;g STXeq/ kg）毒素的剂量，分别作为低剂量和高剂量对斑马鱼进行腹腔注射毒素处理，在毒素处理后的一段时间内的 不同时间点，对注射毒素后斑马鱼的脑组织通过电子显微镜和RT-PCR所发生的一切变化进行研究。研究表明低剂量束丝藻毒素导致染色质浓缩，细胞膜起泡，以及凋亡小体的出现；而高剂量毒素则会引起细胞质空泡化，线粒体肿胀和内质网的扩张。具体表现为在早期时间点（3小时），许多细胞表现出凋亡和坏死的特征，在随后的时间段内，低剂量组中脑细胞以凋亡占优势，而高剂量组中则是以细胞坏死占主导地位。 RT-PCR结果显示，p53，Bax，caspase-3和c-Jun基因的含量在注射束丝藻毒素后发生表达上调，但没有观察到DNA损伤的存在。这表明细胞凋亡可以通过独立于DNA损伤的片段化的途径发生。这些研究结果表明束丝藻毒素可能导致斑马鱼脑组织中的细胞死亡，同时表明低剂量毒素引起细胞凋亡，而更高剂量毒素则诱导细胞坏死。

关键词：束丝藻毒素; 细胞凋亡; 脑; DNA损伤; 超微结构; 斑马鱼

1、引言

致毒性蓝藻产生的麻痹症贝类毒素（PSPs）正在越来越多地蔓延到世界范围内的富营养化水体（Pereira et al。，2000;Pomati等，2000; Ferreira等人，2001; Liu等人，2006年a，B; Ballot等，2010; Ledreux等，2010）。鉴于其毒性和广泛的地理区域图形分布，PSPs已经吸引了很多科学家和公众的关注。在过去的15年里，几乎每年都在中国云南省滇池发生束丝藻水华。由于湖泊在持续的营养供应和水温方面提供了有利的环境，现在水华往往会持续不止6个月（从11月到次年的6月）。滇池是重要的饮用水和农业淡水资源，服务于中国云南省昆明市附近超过5亿的人口。它也是一个重要的旅游目的地，广泛用于娱乐活动。因为滇池水华涉及到的主要的蓝藻种类已被证明可以合成PSPs（Liu等人，2006a，b），所以这种水华蔓延对人类健康和生态环境构成重大威胁，并对当地经济造成越来越多的不利影响。

PSP是第一种有效的生物碱神经毒素,其存在于海洋物种，主要是鞭毛藻中（Shimizu，1977; Catterall，1980; Harada等，1982）随后也发现其存在于在淡水蓝藻 （Pereira等，2000; Pomati等，2000; Liu等，2006年a; Ballot等，2010; Ledreux等，2010和菌类之中（Gallacher等，1997; Baker等，2003）。至今为止人们已经发现有30种结构上相关的天然PSP分子，全部含有两个胍部分（Hall等，1990; Oshima等，1993; Wright，1995;小野寺等，1997; Kodama，2000; Llewellyn，2006; Ara#39;oz等，2010）。尽管基本的PSP分子骨架都包括3,4,5-三氮基四氢嘌呤分组，但根据其毒素侧链的化学结构不同可分为三类：（1）N-磺基氨基甲酰基，（2）十氨基甲酰基和（3）氨基甲酸酯（图1）。 N-磺基 - 氨基甲酰基毒素包括C1-C4，B1（GTX5），和B2（GTX6），这些毒性最低。十氨基甲酰基包含中等毒性的毒素dc GTX1-dc GTX4，dcneo STX和dc STX。氨基甲酸酯含有膝沟藻毒素（GTX1-GTX4），新石房蛤毒素（NEO）和蛤蚌毒素（STX），这些都是毒性最大的PSP分子（Oshima，1995）。

事实证明，PSP的毒性问题更为复杂，PSP毒素对高温，酸和碱有很强的抵抗力，因此大多数烹饪方法都不能去除毒素，从而得到不受污染的食物。例如，据报道PSP的毒性在0.1N HCl中或pH 9的碱性溶液中或长时间沸腾时都不会受影响（Garcı#39;a等，2004）（Gastro等，2004）。虽然PSP毒性可以通过结合培养基中的其他物质来降低（Gastro等人，2004），但简单的过滤依旧不太可能将毒素从饮用水中去除。

由于滤食甲藻和蓝细菌的生活习性，PSP在水生生物群中积累，如海水贝类和淡水贻贝中的毒素浓度就很高。随后人类食用受PSP污染的食物通常会导致瘫痪，而且贝类中毒具有显着的发病率和死亡率（Hall等，1990）。 PSP中毒的症状包括嘴唇和舌头的感觉异常、虚弱、嗜睡、共济失调、呼吸困难、恶心、呕吐、低血压、心跳加速以及肌肉和上肢肢体无力，严重时甚至停止呼吸导致死亡（Negri等，1995; David等，2004; Garcı#39;a等，2004,2005）。之前在美国有报道说，PSPs积累于双壳类肝胰脏（Shimizu，1986）和猫的肝脏和脾脏中（Andrinolo等，1999），并且在小鼠体内PSP导致多发性骨髓瘤的发生率降低，其影响包括谷胱甘肽过氧化物酶在内的多种肝脏酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）、乙氧基环氧树脂-O-脱乙基酶和penthoxyresorufin-O-脱乙基酶的表达（Hong等人，2003）。PSP使得猫的循环系统也受到影响，并且其毒性作用包括降低血压、多种心律失常、T波倒置、心脏减少血液输出、减少静脉回流造成心肌低氧血症和心脏骤停，都表明PSP发挥对心肌细胞和钠离子通道的快速直接毒性效应 （Andrinolo等，1999），将会导致心血管休克（Chang等，1992）。另外，PSP的降血压作用也是如此作用于豚鼠（Chang等，1992）、狗（Stri-chartz，1984; Moczydlowski等，1986; Guo等，1987;Hall等人，1990）和人类（Long等人，1990）。据报道，PSP在人类体内发挥显着的毒性，如在呼吸系统中的作用，包括肺充血和水肿（Garcı#39;a等，2004）。在小鼠体内，已经发现PSP 肯定与肺上皮细胞的超微结构异常（Undredal等，1999; Liu等，2006a）和呼吸停止有关（Borinson等，1980; Andrinolo等，1999）。在哺乳动物物种的排泄过程中，PSP则主要由肾小球滤过泡介导（Andrinolo等，2002a）。

除了这些不同的全身效应外，人们发现PSPs的毒性主要作用在大脑中。准确的说，是因为PSPs被认为在中枢神经系统（脑和延髓）（Borison等人，1980; Andrinolo等1999）能够穿越血脑屏障（BBB）（Andrinolo等人，1999年），尽管也有相反的观点同样被提出（Evans，1975）。在脑中PSPs通过作用于钠离子运输通道（Lagos和Andrinolo，2000; Andrinolo等人，2002年a，b）阻断神经元信号传递，对其他通道包括钾离子通道（Wang et al。，2003）和L型钙通道（Su et al。，2004）的影响也有报道。尽管在PSPs在中枢神经系统的主要分子靶点已经得到很好的研究，但许多未解决的关于毒性影响的潜在机制的问题仍然受到关注，并有越来越多的证据表明，PSPs的作用远不止对神经元反式作用的抑制。因此我们试图验证斑马鱼注入PSPs后的一些变化（Danio rerio）。在本研究中，粗制毒素是从滇池培养的水华束丝藻中分离提取得到， HPLC分析证实存在PSP，我们使用低剂量和亚致死剂量的毒素制剂来处理斑马鱼并在不同时间点检测脑组织超微结构、DNA损伤以及凋亡相关基因的表达的异同。我们报告说PSPs在鱼类中枢神经系统中产生了不同的变化，包括细胞坏死和细胞凋亡对应的施用的剂量。了解PSPs注入后发生的变化对于我们开发预防性和治疗性措施来对抗水华束丝藻的PSPs毒性的过程极为重要。

  1. 材料和方法

2.1、化学制品

TRIzol和RT-PCR试剂盒购自Invitrogen和Promega（美国）。石房蛤毒素（STX）组毒素（dc STX，STX，neo STX）和膝沟藻（GTX）组毒素（GTX1-5，dc GTX2,3）标准液，购自National Research加拿大理事会（NRC， Halifax，NS，加拿大）。去离子水，使用Milli-Q水纯化系统（Millipore，法国）制备水。所有其他化学品，除非特殊说明，否则，均使用商业来源可用的最高等级。

2.2、滇池水华束丝藻的培养

我们从湖中采集了2002〜2003年滇池水华的束丝藻的样本（Liu et al。，2006a），采样、隔离、鉴定和培养藻类的细节技术在其他地方被提出（Pereira等，2000;Liu等人，2006a，b）并稍作修改。简而言之，首先将毛状体在50mL的灭菌的BG11 培养基（25plusmn;2 ℃，光照：暗周期为16 h：8 h，光照强度30 mu;mol 光子m-2s-1）中培养20天，每日手动搅拌两次，然后稀释到2L的无菌BG11培养基并在相同的条件下培养20天以产生储存培养物。大型藻类通过稀释原种培养物（2L）转入4 times; 10 L无菌BG11培养基（细胞浓度1times;104细胞/ m L）;培养物在25plusmn;2℃，冷白荧光管连续照明（40 mu;mol光子m-2s-1）和通入无菌空气的环境下培育。 35至40日后收获培养物，此时是毒素产量最高的阶段（详情见Liu等人，2006b）。细胞使用GL-10LM离心机（湖南兴科科学仪器有限公司，中国）离心（5640 times;g，10℃，10分钟）并冻干（Yamato Scientific Co.，Tokyo，日本），产生总计17.87克（干重）的细胞;在进一步分析之前将它们储存在-20℃冷藏。

2.3、束丝藻毒素的提取和纯化

提取和纯化束丝藻毒素的方法依照先前发表的方法（He et al。，2005;Liu等人，2006a，b）稍作修改。简而言之，将1.93g冻干的干细胞与200mu;L的0.01M乙酸溶液混合（4℃），在冰浴中超声处理（Digital Sonifier250）15分钟，剧烈搅拌30分钟（25℃），然后冷冻/解冻两次（以促进释放的毒素进入培养基）。

对制剂进行检查：在显微镜下确认99％细胞裂解。裂解液通过离心（5900times; g，4℃，10分钟）澄清、收集上清液并重新提取沉淀再次用0.01M乙酸溶液（4℃）澄清。像之前一样将两种上清液合并通过加入20mL无水乙醇（v：v，9：1）使大分子沉淀。离心（5900times;g，4℃，10分钟），将上清液连续通过5.0，0.45和0.22mu;m过滤膜，使用旋转蒸发器浓缩至干（R-210-Buchi，瑞士）。残留物被摄入50mL0.01M乙酸，再次蒸发至干燥，溶于25m L 0.01M乙酸溶液中。上述过程重复三次，合并得到75mL的毒素提取物。 提取物通过Sep-PakC18墨盒（Waters）进行纯化， Sep-Pak C18墨盒首先加入8mL的无水甲醇，然后加8ml去离子水; 3mu;L等分试样将大象素提取物装载到药筒上，并且首先用3mL去离子水进行洗脱然后用10毫升酸化的甲醇洗脱。将洗脱液收集并使用旋转蒸发仪浓缩至干燥（R-210-Buchi，瑞士），然后吸收至3mL0.01M乙酸溶液中并在-20℃冷冻保存,用于随后的HPLC分析和毒理学研究。

2.4、束丝藻毒素浓度测定和毒素的HPLC分析

所有使用的化学品和溶剂都是HPLC或分析级。 PSPs的毒素分析如先前报道的，使用包括离子对色谱和柱后衍生的荧光检测的Shimadzu LC20A HPLC系统进行（Oshima等，1989; Oshima，1995; Diener等，2006；Liu等人，2006b），有轻微的修改。

简而言之，通过10,000Da过滤器（Amicon，ultra-4，Millipore Co.）对储存的冷冻提取物进行超滤。使用基于二氧化硅的反相柱（Shim-Pack，Inc。），与STX（dc STX，STX，neo STX）和GTX（GTX1-5，dc GTX2,3）的参考标准液在配备荧光监测（LC20A，RF-10AXL，Shimadzu，日本）的HPLC仪器中并行分析 (Shim-Pack,VP-ODS，250Ltimes;4.6，日本岛津）。将10mu;L用于分析的样品注入硅基反相柱（Shim-Pack，VP-ODS，250L times; 4.6，Shimadzu，日本）中，而用于检测和定量GTX基团毒素的流动相为10 m M磷酸铵缓冲液中加入2 m M庚烷磺酸盐（p H 7.2）;用于分析STX的流动相为30m M磷酸铵缓冲液（p H 7.2）：乙腈[100：5（v / v）]中加入2m M庚烷磺酸盐。流量分别设定为0.8和1.0mL / min。在这两种情况下，从

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