CRISPR-Cas9在基因组工程中的发展与应用外文翻译资料

 2021-11-30 18:56:38

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CRISPR-Cas9在基因工程中的研究与应用

CRISPR-Cas9在基因组工程中的发展与应用

摘要：基于crispr相关RNA引导的核酸内切酶Cas9的基因组工程技术的最新进展使系统地研究哺乳动物基因组功能成为可能。与现代文字处理器的搜索功能类似，Cas9可以通过短RNA搜索串被引导到复杂基因组中的特定位置。利用这个系统，内源性基因组内的DNA序列及其功能输出现在几乎可以在任何生物体中轻松编辑或调节。cas9介导的遗传扰动简单且可扩展，使研究人员能够在系统水平阐明基因组的功能组织，并在遗传变异和生物表型之间建立因果关系。在这篇综述中，我们描述了Cas9在各种研究或翻译应用方面的发展和应用，同时强调了挑战和未来的方向。Cas9源自一个卓越的微生物防御系统，正推动从基础生物学到生物技术和医学的创新应用。

介绍

20世纪70年代重组DNA技术的发展标志着生物学新纪元的开始。分子生物学家第一次获得了操纵DNA分子的能力，使研究基因成为可能，并利用它们开发新的药物和生物技术。基因组工程技术的最新进展正在引发一场生物学研究的新革命。研究人员现在可以选择任何生物，在内源环境中直接编辑或调节DNA序列的功能,而不是在脱离基因组背景环境中研究DNA。这使他们能够在系统层面阐明基因组的功能组织,以及识别有关的基因变异。

广义上讲，基因组工程是指对基因组、其环境(如表观遗传标记)或其输出(如转录本)进行有针对性的修改的过程。在真核细胞中，特别是在哺乳动物细胞中，这种简单而有效的方法有望改变基础科学、生物技术和医学。

在生命科学研究中，能够删除、插入和修改细胞或有机体的DNA序列的技术能够分解特定基因和调控元件的功能。多路编辑技术可以进一步在更大范围内对基因或蛋白质网络进行研究。同样，操纵特定位点的转录调控或染色质状态，可以揭示细胞内遗传物质是如何组织和利用的，阐明基因组结构与其功能之间的关系。在生物技术中，对基因构建模块和调控机制的精确操作也有助于进行有用的生物系统的逆向工程或重建，例如，增强工业相关的生物体中的生物燃料生产途径或创造抗感染作物。此外，基因组工程正在刺激新一代药物开发过程和医学治疗。同时干扰多个基因可以模拟复杂多基因疾病的叠加效应，从而产生新的药物靶点，而基因组编辑可以在人类基因治疗的背景下直接纠正有害突变。

真核生物的基因组含有数十亿个DNA碱基，很难操作。基因组操作的一个突破是基因靶向同源重组(HR)技术的发展，该技术将供体位点与含有同源序列的外源性修复模板整合在一起(图2A) (Capecchi, 1989)。HR介导的靶向技术通过操纵生殖系感受性干细胞，促进了敲入和敲除动物模型的产生，极大地推进了生物学研究的许多领域。然而，尽管HR介导靶向基因高度精确的改变，但期望的重组事件的发生非常罕见(Capecchi, 1989)，预示着基因靶向实验的大规模应用面临巨大的挑战。

为了克服这些挑战，近些年来发展出一系列基于可编程核酸的基因组编辑技术，使多种真核生物，特别是哺乳动物有针对性和有效的改良成为可能。当前一代的基因组编辑技术,发展最快速的是一类称为Cas9的RNA-引导的内切酶，来源于微生物适应性免疫系统 CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列),它可以很容易地由一条短RNA靶向基因组中任何所选择的位置。在此，我们回顾了CRISPR相关的核酸内切酶Cas9作为一个平台技术的发展和应用，以实现目标干扰内源性基因组的等位基因，并对挑战和未来的创新途径进行了讨论。

可编程核酸酶作为高效和精确的基因组编辑工具

一系列研究使人们认识到，靶向DNA双链断裂(DSBs)可以通HR介导的重组事件极大地刺激基因组编辑。随后，Carroll和Chandrasegaran证明了基于锌指蛋白的设计核酸酶在高效、位点特异性HR方面的潜力(Bibikova et al.， 2001,2003)。此外，在缺乏外源性同源修复模板的情况下，定位的DSBs可以通过易出错的非同源末端连接(NHEJ)修复通路诱导插入或删除突变(indels)(图2A) (Bibikova et al.， 2002)。这些早期的基因组编辑研究建立了DSB诱导的HR和NHEJ为真核生物基因组的多用途精确修饰提供了强有力的途径。

为了通过引入位点特异性DNA DSBs，实现有效的基因组编辑，目前已经设计了四大类可定制的DNA结合蛋白:来自微生物移动遗传元件的归巢核酸内切酶（Meganuclease） (Smith et al.， 2006)、基于真核转录因子的锌指核酸酶(ZF) (Urnov et al.， 2005;Miller等，2007)，来自黄单胞菌的转录激活物样效应器(TALEs) (Christian等，2010;Miller等，2011;Boch等，2009）以及最近的来自II型细菌适应性免疫系统CRISPR的rna引导的DNA内切酶Cas9。

Meganuclease、ZF和TALE蛋白都通过蛋白-DNA相互作用来识别特定的DNA序列。虽然Meganuclease整合了它的核酸酶和DNA结合域，但ZF和TALE蛋白分别由针对3或1个DNA核苷酸(nt)的单个模块组成(图2B)。ZFs和TALEs可以在理想的组合态中组装，并与FokI的核酸酶结构域连接，从而直接向特定的基因组位点进行核反应。然而，这些平台都有各自的局限性。

由于meganuclease蛋白残基与其靶基因序列特异性之间缺乏明确的对应关系，因此尚未被广泛应用于基因组工程平台。另一方面，ZF结构域在组装成更大的集合时，由于相邻模块之间的串扰而表现出背景依赖的结合偏爱(Maeder et al.， 2008)。虽然已经开发了多种策略来应对这些限制(Gonzaelz et al.， 2010;Sander et al.， 2011)，装配具有所需DNA结合特异性的功能性ZFPs仍然是一个主要的挑战，需要一个广泛的筛选过程。类似地，尽管TALE DNA结合单体在很大程度上是模块化的，但它们仍然可能受到背景依赖的特异性的影响(Juillerat et al.， 2014)，而且它们的重复序列使得构建新的TALE集合的工作变得密集和昂贵。

考虑到模块化dna结合蛋白工程的挑战，新的识别模式将大大简化定制核酸酶的开发。CRISPR核酸酶Cas9被短的向导RNA靶向，向导RNA通过沃森-克里克碱基配对识别目标DNA(图2C)。这些CRISPR RNA中的指导序列通常与噬菌体序列相对应，构成了CRISPR抗病毒防御的天然机制，但可以很容易地被一个重新定位Cas9核酸酶的所期望的序列所取代。Cas9的多路复用靶向现在可以通过引入一组短导RNA来实现，而不是引入一个大型的、体积庞大的蛋白质。Cas9的易用性、作为位点特异性核酸酶的高效性以及高复用修饰的可能性，开辟了从生物技术到医学的基础研究的广泛的生物应用。

可定制的dna结合域的功能远远超出了使用特定位点的内切酶进行基因组编辑的范围。将它们融合到模块化、序列无关的功能效应域，可以灵活地将所需的扰动(如转录激活)靶向到感兴趣的位点。事实上，任何模块化的酶成分，原则上都可以被取代，这使得基因组工程工具箱里可以方便地添加新的成分。整合基因组和表观基因组修饰酶与诱导蛋白调控允许对动态过程进一步地精确的时间控制。

最新开发的用于基因组编辑的内切酶Cas9利用了十多年来的研究基础，这些基础研究旨在理解神秘的重复元素(现在称为CRISPR)的生物学功能(图3)，这些重复元素存在于多种细菌和古细菌中。CRISPR位点通常由一簇的CRISPR相关(Cas)基因和一个标志性的CRISPR阵列组成。CRISPR阵列是由一系列重复序列(直接重复)，被与外来基因元件(原pacers)中的序列相对应的可变序列(间隔子)间隔而组成。虽然Cas基因被翻译成蛋白质，但大多数CRISPR阵列首先被转录成单个RNA，然后再被加工成更短的CRISPR RNA (crRNA)，后者指导某些Cas酶的核水解活性，降解目标核酸。

CRISPR的故事始于1987年。在研究大肠杆菌碱性磷酸酶同工酶转化中涉及的iap酶时，Nakata和同事报告了iap基因下游的29个nt重复序列(Ishino et al.， 1987)。与大多数重复元件不同，这些元件通常采用串联重复序列，如TALE的重复单体，这29个nt重复序列之间间隔着5个插入的32个nt非重复序列。在接下来的10年里，随着更多的微生物基因组测序，从不同细菌和古细菌的基因组中又发现了更多的重复元件。Mojica和他的同事最终将间隔重复序列划分为一个独特的簇状重复元件家族，该家族存在于40%的已测序细菌和90%的古菌中(Mojica et al.， 2000)。

这些早期发现开始激发人们对这些微生物中重复原件的兴趣。到2002年，Jansen和Mojica创造了CRISPR的首字母缩写来统一描述由间隔重复序列组成的微生物基因组位点(Jansen et al.，2002;Barrangou和van der Oost, 2013)。同时,几簇署名为CRISPR相关的(cas)基因被确定是保守的,通常与重复元件相邻(Jansen et al ., 2002),作为最终被分类的三种不同类型的CRISPR系统的基础 (Haft et al., 2005; Makarova et al., 2011b)。I型和III型CRISPR位点包含多个Cas蛋白，现在已知它们与crRNA形成复合物(I型的级联复合物;III型的Cmr或Csm RAMP复合物)，以促进目标核酸的识别和破坏(Brouns et al.， 2008;Hale等人，2009)(图4)相反，Ⅱ型系统显著减少了Cas蛋白的数量。然而，尽管CRISPR基因座在许多微生物物种间的定位和注释越来越详细，但它们生物学上的意义仍然难以捉摸。

一个关键的转折点出现在2005年，当时对分离单个直接重复序列的间隔序列进行系统分析，结果表明它们具有染色体外和噬菌体相关的起源(Mojica et al.， 2005;Pourcel等，2005;Bolotin等，2005)。这一发现非常令人兴奋，尤其是考虑到之前的研究表明CRISPR位点是转录的(Tang等，2002)，并且病毒无法感染携带与自身基因组相对应的间隔的古细菌细胞(Mojica等，2005)。综上所述，这些发现导致了一种推测，CRISPR阵列作为一种免疫记忆和防御机制，单个间隔体通过核酸之间的沃森-克里克碱基配对促进对噬菌体感染的防御(Mojica et al.， 2005;Pourcel等，2005)。尽管有这些令人信服的认识，CRISPR位点可能与微生物免疫有关，但间隔体如何介导病毒防御的具体机制仍然是一个具有挑战性的谜。几个假设被提出，包括CRISPR间隔充当小RNA向导，以类似RNAi的机制降解病毒转录本(Makarova et al.， 2006)或CRISPR间隔引导Cas酶在间隔匹配区域裂解病毒DNA (Bolotin et al.， 2005)。

在食品原料公司处理乳品生产菌株乳酸链球菌的Danisco，Horvath和他的同事们发现了II型CRISPR系统在自然界中的角色是一种适应性免疫系统的第一个实验证据,展示一个以核酸为基础的免疫系统，其中CRISPR间隔区决定目标特异性而Cas酶控制间隔采集和噬菌体防御(Barrangou et al ., 2007)。随后很快一系列的研究阐明了CRISPR防御机制，帮助建立了CRISPR位点三种类型的适应性免疫的机制和功能。通过对大肠杆菌I型CRISPR位点的研究，van der Oost及其同事发现，CRISPR阵列被转录并转化为包含单个间隔的小crRNA，以指导Cas核酸酶活性(Brouns et al.， 2008)。同年,来源于葡萄球菌的CRISPR介导的防御类型III-A CRISPR系统表明，建立对质粒接合的阻碍作用时，Cas酶活动的目标是DNA而不是RNA (Marraffini和Sontheimer 2008),尽管后来对来源于强烈火球菌的不同类型的III-B系统的调查还揭示crRNA对RNA靶向切割的功能(Hale et al.， 2009,2012)。

随着CRISPR研究的步伐加速,研究人员迅速瓦解每种类型的CRISPR系统的很多细节(图4)。建立在先前对原间隔序列相邻基序(PAMs)可能介导II型Cas9核酸酶切割DNA的猜测上(Bolotin et al ., 2005), Moineau和他的同事们强调了PAM的重要性，表明PAM突变序列的噬菌体基因组可以规避CRISPR干扰(Deveau et al ., 2008)。此外，对于类型I和类型II，CRISPR阵列中直接重复序列中没有PAM时，CRISPR系统无法进行自定位。然而，在III型系统中，质粒干扰需要crRNA的5rsquo;端和DNA靶点之间的错配(Marraffini和Sontheimer, 2010)。

到2010年，CRISPR在细菌免疫方面的第一个实验证据出现仅仅3年后，CRISPR系统的基本功能和机制就变得越来越清晰。各种团体已经开始利用天然CRISPR系统进行各种生物技术应用，包括产生抗噬菌体的乳制品培养物(Quiberoni et al.， 2010)和菌株的系统发育分类(Horvath et al.， 2008, 2009)。然而，基因组编辑的应用还没有被探索。

大约在这个时候，两项研究描述了II型CRISPR系统的天然的功能机制，阐明了对于设计用于基因组编辑的简单的RNA可编程的DNA内切酶的必要基本组件。首先，Moineau和他的同事通过对嗜热链球菌基因的研究发现Cas9(以前称为Cas5、Csn1或Csx12)是Ca

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