Fe3O4@PAM@NTA-Ni2 磁性复合纳米粒子能够高特异性分离组氨酸标签蛋白外文翻译资料

 2021-12-02 22:27:09

英语原文共 7 页

标题：Fe3O4@PAM@NTA-Ni2 磁性复合纳米粒子能够高特异性分离组氨酸标签蛋白

摘要：通过丙烯酸和丙烯酰胺在Fe3O4纳米粒子悬浮液中共聚的简单方法，可以制备表面带有羧基的Fe3O4@PAM(聚丙烯酰胺)纳米粒子。硝基三乙酸(NTA)通过著名的碳酰亚胺化学方法（即通过二氯乙烷(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)）偶联到磁性纳米粒子上。Ni2 负载在纳米粒子表面，可以为组氨酸标签绿色荧光蛋白（记作组氨酸标签GFP）的固定化提供了丰富的锚定位点。Fe3O4@PAM@NTA-Ni2 与组氨酸标签蛋白有着高结合能力(42mu;g蛋白质/mg纳米粒子)，且能纳米粒子的高磁允许它可以在简单的条件——一个外部磁场下达到分离纯化的目的。在不会显著丧失与蛋白质的高结合能力前提下，纳米粒子至少可以循环四次使用。这表明了此材料有着在工业规模上、低成本纯化分离组氨酸标签蛋白的巨大潜力。

关键词：磁性纳米颗粒；聚丙烯酰胺；蛋白质分离；组氨酸标签蛋白质

1.引言：

磁性复合纳米颗粒由于其优异的磁响应以及在蛋白质纯化[1,2]、细胞分离[3,4]、靶向给药[5,6]、医学诊断[7,8]等生物医学领域的应用，引起了科学技术界的广泛关注，特别是具有特定功能高分子外壳的核/壳结构磁性高分子纳米粒子，这是因为其表面官能团密度高、易改性等特点。

在蛋白质工程中，组氨酸标签重组蛋白应用广泛，其纯化具有重要意义。在各种分离方法中，固定化金属亲和层析(IMAC)[10]是一种选择性、可靠的分离组氨酸标签蛋白的通用方法，它依赖于固定化金属离子与蛋白表面的组氨酸等供电子基团之间的相互作用。将磁性纳米颗粒或微球与IMAC的优点相结合形成一种强有力的组氨酸标签蛋白分离技术，近年来这一领域备受关注[11-13]。这些微球在富集和分离组氨酸标记的重组蛋白或天然富组蛋白方面表现出显著的良好性能。但由于磁性易聚集、表面不稳定、合成复杂、实验耗时长等原因，限制了该方法的应用。

在此，我们设计并合成了功能化的超顺磁Fe3O4@PAM@NTA-Ni2 纳米粒子，能够从模型混合物中普遍有效地富集组氨酸标签蛋白。结果表明，纳米颗粒可以一步分离纯化组氨酸标签蛋白，这在生物技术上有所应用。设计精良的磁性纳米颗粒具有以下引人注目的优点：(1)高磁响应的Fe3O4核心只需使用一个外部磁铁在5分钟内就可以轻松实现分离，而传统的蛋白质分离一般需要2-3小时。(2)使用组氨酸标签GFP作为模型化合物，纳米颗粒拥有一个优异的蛋白质结合能力（42mu;g 组氨酸标签GFP /mg 纳米颗粒），高于被报导的商业磁性微珠的性能(10-12mu;g蛋白质/mg的珠)[14、15]。(3)容易实现可逆吸附与脱吸附，回收率高，可回收性好。实验结果表明，Fe3O4@PAM@NTA-Ni2 纳米颗粒在组氨酸标签蛋白的分离中表现优异，在未来的蛋白质的实际应用中具有很大的潜力。

  1. 实验

2.1 材料

六水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)，六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)，氨水溶液(25%-28%)，一水合柠檬酸(C6H8O7·H2O)，丙烯酰胺(AM)，丙烯酸(AA)，无水乙醇，咪唑(99%)，Na2HPO4·12H2O，NaH2PO4·2H2O，氯化钠，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，过硫酸铵(APS)，四甲基乙二胺(TEMED)和六水合氯化镍(NiCl2·6H2O)，均购自上海化学试剂有限公司。N,N-甲基双丙烯酰胺(bis-AM)购自阿拉丁。Nalpha;,Nalpha;-bis(羧甲基)-L-赖氨酸水合物(氨基丁基 NTA)购自fluka公司。EDC·HCl购自上海Medpep有限公司。组氨酸标签GFP由Su教授提供，用于所有实验的去离子水均取自Milli-Q系统(Millipore, Bedford, MA)。

2.2 合成Fe3O4磁性纳米颗粒

FeSO4·7H2O（0.75 mmol）和FeCl3·6H2O（1.5 mmol）分别溶于水中（20 mL），在氮气中缓慢搅拌。室温下将10mL氨水(25%，质量分数)缓慢滴入水溶液中。在剧烈搅拌下，将0.78mmol的一水合柠檬酸快速倒入水溶液中，75-80℃下反应0.5小时。然后，冷却至室温。得到的黑色产物，乙醇洗涤三次，每次用磁铁收集产物，最后将产物分散在水中，并调整浓度为4.2 mg/mL。

2.3 磁性纳米颗粒Fe3O4@PAM核/壳的合成

以AM和AA为反应物，以bis-AM为交联剂，以TEMED和APS (30 %，质量分数)为共引发剂，通过简单的溶液聚合，合成了核/壳结构Fe3O4@PAM纳米颗粒。通过改变合成中AM / AA的比例可以调节表面官能团的密度。保持AM和AA总重量不变( ( mAM mAA )/mFe3O4=4.5 )，AA用量由质量分数3.9%增加到质量分数30%。将30 mg Fe3O4磁性纳米颗粒分散在50 ml的水中，再倒入100 mL三颈烧瓶中。然后将AM、bis-AM和AA的混合物加入烧瓶中，室温下在氮气中搅拌0.5h后，将反应混合物加热到45-50℃。接着，加入5mu;L TEMED和10 mu;L过硫酸铵（质量分数30%）。45-50℃下反应5小时。将产生的Fe3O4@PAM纳米颗粒用磁铁收集，用乙醇洗涤三次，除去多余的反应物后，再分散在水中。把磁性纳米颗粒的水溶液浓度调整为0.9 mg/mL。

2.4 Fe3O4@PAM@NTA-Ni2 纳米颗粒的合成

20 mL 0.9 mg/mL的Fe3O4@PAM的悬浮液和30 mg（0.156 mmol）搅拌30分钟，然后与30mg（0.261mmol）NHS混合搅拌为1.5小时。接着再加入溶解在8.5 mL、0.5 M、pH 9.5的Na2CO3 / NaHCO3缓冲溶液的5 mg（0.03 mmol）的NTA。室温下反应24小时后通过磁铁收集。分离得到的Fe3O4@PAM@NTA纳米颗粒用纯净水冲洗三次，再悬浮于20 mL水中。向Fe3O4@PAM@NTA悬浮液中加入20 mL，0.1 M氯化镍溶液，室温搅拌30分钟。用磁铁从溶液中分离产品后用纯净水冲洗三次。所得的Fe3O4@PAM@NTA-Ni2 纳米颗粒在40℃真空烘箱中干燥，储存备用。

2.5 Fe3O4@PAM@NTA-Ni2 分离提纯组氨酸标签GFP

首先用乙醇洗三次Fe3O4@PAM@NTA-Ni2 纳米颗粒，然后将其悬浮在1 mL缓冲溶液Ⅰ（50 mL PBS缓冲液，50 mM氯化钠，5 mL咪唑，和6 M尿素，pH值8.0）中。50mu;g 组氨酸标签GFP母液(1mg/mL))与纳米颗粒混合并在室温下震荡孵育20分钟。磁分离去除上清，纯净水洗涤两次蛋白结合复合纳米颗粒，去除非特异性吸附蛋白。随后，用缓冲液Ⅱ（50mM PBS缓冲液，50 mM NaCl缓冲液，500 mM咪唑缓冲液，6 M尿素缓冲液，pH值8.0）从纳米粒子中直接洗脱被捕获的组氨酸标签GFP。为了定量Fe3O4@PAM@NTA-Ni2 磁性纳米颗粒的蛋白结合能力，我们收集了每一步的蛋白溶液（包括原液、上清液和洗脱液），并对溶液进行冻干，用于在280 nm处紫外-可见光分光光度检测和SDS-PAGE分析。

2.6 Fe3O4@PAM@NTA-Ni2 分离提纯组氨酸标签GFP回收率调查

首先用乙醇洗三次Fe3O4@PAM@NTA-Ni2 纳米颗粒（1 mg），然后将其悬浮在100mu;L缓冲溶液Ⅰ中。50mu;g 组氨酸标签GFP母液(50mu;g，1mg/mL)与纳米颗粒混合并在室温下振荡孵育20分钟。纯净水洗3次后，用缓冲液Ⅱ直接从磁性纳米颗粒上洗脱捕获的组氨酸标签GFP。纳米颗粒与氯化镍溶液继续螯合5分钟后，再次进行分离实验。整个实验过程重复四次，收集并冻干每一步的洗脱液，并用于进行SDS-PAGE分析。

2.7磁性纳米颗粒的表征

使用透射电镜（TEM，200kV）观察了磁性纳米颗粒的形貌。通过将样品吸进铜质电镜网格制备透射电镜样品。利用透射电镜图像计算了磁性纳米颗粒的平均直径。超声波2分钟后，使用NanoS Zeta Sizer （Malvern Instruments）测量磁性纳米颗粒的粒径和zeta电位。平行三次测量每个样本控制平均粒径的误差范围。FT-IR光谱仪（Nexus）测量红外光谱数据。扫描光谱在400-4000cm-1范围内通过X射线衍射（XRD）的特定模式（带铜Kalpha;的粉末衍射仪（D / MAX-RB）辐射为30 kV和30 mA）下对晶体相样品进行检测，模式验证记录。在动态热机械分析仪（PYRIS serles 7e type DMA TAOAB SYSTEM）上进行热重分析（TGA）测量。所有的测量都是在氮气中进行的。温度先从室温以10 ℃/分钟的速度增加到800 ℃。采用微紫外分光光度计（NANODROP 2000c，Thermo Company of US）测定组氨酸标签GFP的浓度。十二烷基磺酸丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）采用16%聚丙烯酰胺凝胶。

3.结果与讨论

合成复合磁性纳米粒子的过程如示意图1所示。首先，以一水合柠

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