对CRISPR-Cas的生物学概述外文翻译资料

 2022-07-22 12:23:29

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主题简介

对CRISPR-Cas的生物学概述

当面临不同环境胁迫，包括由可动遗传因子传递的胁迫，原核细胞（如噬菌体和质粒）用不同策略去提高适应性。很多细菌和古细菌利用叫做CRISPR-Cas体系的简洁、由RNA指导、核酸靶向、自适应限制机械来防御这些因素。当体系提供一个应对外来基因片段的有效防御的同时，系统也在调节环境胁迫下的细菌的生理机能方面扮演重要角色。CRISPR-Cas系统，特别是包含Cas9核酸内切酶的II型体系，日益被用来连接期望得到的核酸序列和序列特异性目标片段裂解。作为一个无数体系中的操纵基因的通用便携式平台，Cas9介导的基因工程超越了生物研究。这里，我们对CRISPR-Cas的历史和生物性做了一个系统概述，重点突出来自这些体系、极大扩展分子生物学家工具包的创新型工具。

简介和历史

数十年来，CRISPR-Cas系统的作用和目的还是个谜，直到一系列对这些原核细胞的适应性免疫系统和对它们如何被针对性基因利用的探索的生物研究，经过敏锐的观察发现了这一扩展领域。这一领域的快速发展被称为“CRISPR狂热”，而且被科研机构广泛认定为已经改革了基因工程。第一次理论验证实验证明这些系统可以当做基因工程工具被重新编码和利用之后仅三年，Cas9技术不仅被用来在各种组织和模式系统中产生基因敲除突变体，而且有各种用途，包括但不仅限于，转录抑制、DNA定位激活和活细胞成像。

关于CRISPR-Cas系统的研究不知不觉已经开始了25年之久了，这是为少数人知道的。那时候，在Escherichia大肠杆菌基因组中，间插不重复序列（被称为“间隔区”） 的一系列短而重复的DNA序列被识别（20-40bp的长度，被称为“重复区”）是跟着基因编码的碱性磷酸酶转换酶同工酶的顺序排列。与此同时，这些序列的作用和目的是未知的。然而，20年后，计算分析发现，这些重复序列在许多细菌和古生菌中都有存在，特别是，间隔区对许多外源可移动遗传因子（如质粒、转位子、噬菌体）中的序列都有特异性。更深入的生物信息学研究揭示，这些被称作CRISPR的序列，经常和一系列Cas基因联系在一起。许多Cas基因和核酸内切酶和螺旋酶家族或者基因编码的其它核酸连接蛋白有序列相似性。很多间隔区和可移动遗传元件是完全相同的，结合这一发现，引发了一个假设：CRISPR-Cas系统可能作为RNA指导的对外来遗传元件干扰的一种形式。这一假设在2007年经过一系列基础实验被认可，实验提供第一手证据证明CRISPR序列和相关Cas蛋白指导对噬菌体感染的干扰。可能，更有趣的是，新的间隔序列很自然地随噬菌体感染进入到CRISPR序列中，然后促进对违规噬菌体序列特异性的依赖，同时在原核生物中也是适应性免疫的一种机制。

在过去8年中，RNA指导的CRISPR-Cas系统干扰机制大部分已被发现。简单来讲，CRISPR调节的干扰发生在三个初级阶段：（1）间隔采集；（2）crRNA转录和成熟；（3）目标识别和切割。在间隔采集阶段，外源核酸被识别加工为短的、间隔大小的序列，被插入到CRISPR序列中，两侧围绕一对重复序列。然后CRISPR序列被转录加工为成熟小RNA，叫做crRNAs，它们每个都包含重复序列和单个间隔区部分，促进对一个目标核酸（有与间隔序列互补特征片段）的识别。crRNAs复合Cas蛋白，而且，在有些情况下，额外的RNAs和目标连接，导致目标裂解。

CRISPR-Cas生物领域在快速持续扩张，很多组织已经慢慢发现了CRISPR-Cas系统在抵御外源核酸方面的分子功能，还有关于这些系统变革和他们在其他生理过程中的作用的一些线索。最近，这项基础工作已经引起对这些系统，特别是CRISPR关联的核酸内切酶Cas9，如何工程化应用于生物技术的探索。

CRISPR-Cas系统的类型

CRISPR-Cas系统因为由临近CRISPR序列编码的独特Cas蛋白可被划分为三种主要类型，TypeI、II、III。除了在原核细胞适应性方面的保守功能，CRISPR-Cas系统在结构和力学方面是多样化的。在免疫适应阶段，这三种CRISPR-Cas类型是最稳定守恒的。在这一过程中，在所有已知编码Cas蛋白的系统中，Cas1和Cas2。这两种金属依赖核酸酶对间隔采集都是充分必要的，但是对目标干扰是非必需的。最近，已知的Cas1和Cas2的晶体结构表明，这两种蛋白在体外形成稳定异二聚体复合物，而在体内，Cas1和Cas2的相互作用在新间隔整合期间对于识别CRISPR重复序列的DNA二级结构来说是很必要的。Cas1的催化活性对间隔采集是必不可少的，而Cas2的预测核酸酶活性位点不是。CRISPR-Cas系统多种类型证据表明，Cas1和Cas2可能和参与目标识别和裂解的Cas蛋白形成复合物。间隔采集可能需要其他Cas蛋白来准确选择序列，保护CRISPR-Cas系统不目标识别伤害自身染色体间隔序列和其转录的crRNAs。具体细节在下面类型II系统部分讲解。

CRISPR-Cas系统不同类型间的差异在crRNA成熟、目标识别和免疫干扰阶段越来越明显。 尤其是，I、III类型系统用大的多聚体蛋白复合物，而II类型系统为了多种功能只需要单个蛋白。I类型系统利用核酸内切酶Cas6或Cas5d来切割每个间隔侧面的重复序列里面的CRISPR序列副本，形成一个短的5rsquo;端重复导出序列和一个3rsquo;端发夹结构，包括一个重复导出序列。之后Cas6蛋白转运成熟crRNA到一个Cas蛋白复合物——Cascade（抗病毒防御的CRISPR关联复合物）上面去，这一复合物有干扰作用，在一些情况下持续连接到crRNA上并且成为干扰复合物的一部分。I类型系统形成一个有四五个不同Cas蛋白的干扰复合物，每个Cas蛋白有不同的化学计量。冷冻电子显微镜显示这个复合物结构表明，六个Cas7（一种有和RNA识别基序类似的的铁氧化还原蛋白折叠的蛋白）形成一个RNA结合瘠。这个瘠和Cas7多聚体两端锚定有其他Cas蛋白的crRNA连接。当这个crRNA连接到目标DNA的时候，构想的改变引起Cas3核酸内切酶（是I类型系统的特征Cas蛋白，介导目标降解）的补充。

和I类型系统一样，III类型系统也用Cas6来做crRNA的加工，并形成靶向干扰的多聚蛋白复合物。然而，III类型系统复合物中的Cas蛋白不一样。Cas10是类型III干扰复合物的一部分，而且是这些系统的定义Cas蛋白 ，虽然它的作用还未被阐明。III类型系统的冷冻电镜结构表明，crRNA围绕一个包含Csm3（III-A）或Cmr4(III-B)重复单元的Cas蛋白复合物被定位，很像类型I系统中的Cas7重复。有趣的是，类型III-A和III-B系统都可以靶向DNA和RNA。在类型III-A系统中，DNA的降解需要Cas10和直接毗邻连接crRNA3rsquo;端的裂解。类型III-A系统靶向的RNA降解甚至发生在通过Csm3活性位点的6核苷酸间隔，主链的每个特殊亚基个别地裂解目标成为集体片段，入侵核酸为连续精确大小序列。很可能，类型III-B系统中的Crm4主链重复和目标裂解有一个相同作用机制。

crRNA对目标的特异性在不同系统中通过一定机制被增强，来避免非靶向由于连接完全或非完全互补序列产生的干扰，以免宿主染色体可能把细胞错误致死。类型I和II系统通过对一个临近目标的特定核苷酸的识别增强特异性，但在DNA的互补链上，叫做PAM（相邻基序）。PAM识别促进了Cas干扰复合物连接、DNA融化和异源双链RNA:DNA形成（在下面类型II系统中详细描述），并且保护相似或特定序列的自身靶向缺少一个PAM。有趣的是，一些类型III系统可避免通过一个特殊转录依赖DNA靶向机制进入宿主基因组的序列裂解（保证溶原性噬菌体的耐受性，同时防止裂解性噬菌体的产生）。

Cas9介导的crRNA成熟

和类型I和III系统相比，类型II系统需要单个Cas蛋白——Cas9核酸内切酶，来介导crRNA成熟。这个CRISPR序列首先被转录为一个长单链转录体。随后，这个先导crRNA被加工成个体crRNAs，每个对应一个不同靶向有特异性。之后，单一的成熟、间隔特异crRNA和Cas9、反式激活crRNA（tracrRNA）、在CRISPR-Cas位点编码的一个小RNA复合，并且有类型II系统特异性。tracrRNA包含多个亚基结构和一个与CRISPR重复序列部分互补的序列，允许结合到crRNA来促进成熟和与Cas9形成复合物。这个dsRNA核酸内切酶，RNase III，通常由CRISPR远端位点编码，也被crRNA成熟所需。RNase III识别由tracrRNA 创造的dsRNA结构：crRNA双工裂解RNA的两链重复区域的两条链。tracrRNA：crRNA双工连接到Cas9并通过一个未知机制（可能包含外加细菌RNA酶）经历补充过程。双RNA：Cas9复合物接着就可以利用序列互补识别和裂解目标为crRNA间隔。在一些尤其是由病原体-脑膜炎奈瑟菌编码的类型II系统中，crRNAs的成熟不依赖RNase III和tracrRNA。在这种情况下，每个重复序列的内部启动子序列都允许个体crRNAs的转录。这些crRNAs仍需要tracrRNA来和Cas9连接，标明RNA双工对和这个蛋白的相互作用的重要性。

Cas9目标干扰

类型II CRISPR-Cas系统的目标干扰机制已经被发现并且阐明，单独的Cas9和其与DNA和RNA连接的晶体结构也说明了这些。和它在crRNA成熟中扮演的角色相似，Cas9是类型II Cas蛋白的核心，参与目标监测和干扰。

Cas9有一个二裂形态，包含一个较大的alpha;螺旋裂片和一个较小的核酸酶裂片，二者共同组成一个蛤一样的形状，有一个中央通道来放置目标。Cas9首先连接crRNA：tracrRNA双工通过一个位于alpha;螺旋裂片内部空间的带正电荷、富含精氨酸的主题，在这里两个裂片在中心活动结束时候聚在一起。连接到RNA之后，Cas9通过一个首先的构象改变（围绕alpha;螺旋裂片的核酸连接口袋旋转核酸酶裂片）顺着蛋白的长度来创造放置核酸的通道。这样使核酸内切酶域重新定位在通道的两侧，形成一个序列靶向裂解的有利构象。

Cas9之后必须高精确度扫描DNA来识别靶向序列，以免靶向自身染色体。这个部分由毗邻靶向DNA被标记区域的PAM主题（典型3bp）完成。Cas9随机关联或不关联在一个DNA链上，直到遇到一个PAM序列。随后，PAM和Cas9的相互作用域通过两个连接环紧紧连接到靶向DNA，和PAM的大小沟相互作用。然后，Cas9通过二级构象的改变，锁定DNA目标到顺着两个裂片的中央腔长度方向的地方。和PAM的相互作用导致临近双链DNA的失稳，使靶向序列适应促进连接到crRNA的种子区。如果在间隔区的PAM近端区域靶向序列有接近完美的互补，沿着DNA的溶解将发生在目标碱基对的一条链上，沿着互补间隔区的剩余，形成一个RNA：DNA异源双链。这导致两个DNA链分开，形成明确金属离子依赖型核酸内切酶活性位点。

HNH核酸内切酶域裂解连接到RNA三个核苷酸PAM上游的DNA链，然而，不互补链也被Cas9的核酸酶裂片连接，但是由分离的RuvC域裂解。这些活性位点优先利用Mg作为二价离子，但是也可以利用Mn（也有一点裂解效果），而Ca抑制活性。有趣的是，最近体外运动研究表明，Cas9是一种单一转换酶，随着裂解继续连接在DNA靶向，已经完全裂解的Cas9的命运目前还未知。

Cas9依赖的CRISPR-Cas系统间隔采集

对新间隔采集到CRISPR序列的适应是已知的规范的CRISPR-Cas作用阶段。在类型II-A系统中，CRISPR-Cas系统的所有组成部分（Cas1,2,9,Csn2和tracrRNA）形成一个适应性复合物。一个相似机制可能被其它包含这些部分的类型II亚型利用，不包括Csn2（在类型II-C中没有，在类型II-B亚型中被Cas4取代）。Csn2和Cas4都类似于RecB相似核酸酶，可能因此在适应性方面扮演相似的角色，虽然他们精确的功能还未知。Csn2和Cas4，Cas1和Cas2，对crRNA进程和靶向干扰都是可有可无的。有趣的是，Cas1蛋白出现在和类型I系统集群系统发育的类型II CRISPR-Cas系统中。这可能表明，类型II系统的确切功能通过和Cas9的结合和其他类型的CRISPR-Cas系统，比如类型I系统，来引起发生。

在外源核酸入侵的情况下，CRISPR-Cas系统必须以一种方式选择间隔序列，以免自身免疫。类型II系统通过一个确切的临近最终被集成间隔区的PAM序列来避免自身免疫。在类型II-A系统中，Cas9和Cas1，2和Csn1复合在一起，连接到tracrRNA，识别入侵DNA上的PAMs，利用PAM相互作用域来促进间隔选择。对间隔序列的选择应该有条件要求，因为 一些富集特定间隔序列的PAM序列单独不能被说明。然而，这些要求还未被发现。

Cas9PAM相互作用域突变不能阻止间隔采集，但是导致不临近靶向PAM的间隔的不合作。Cas9的核酸内切酶活性对采集可有可无，鉴于Cas9的角色是通过连接到PAM和原间隔序列来挑选间隔。然而Cas1-Cas2-Csn1复合物中的Cas1（其非特异性核酸酶活性为适应所需）裂解临近序列，产生精确选择的间隔序列。适应机制有很多未知的东西，但是一个大致模型已经产生。Cas1-Cas2一起感染阵列中CRISPR重复序列的二级结构，临近的先导序列（也是启动子）优先。染色体阵列中3rsquo;端的的一个重复序列接下来被切割，允许游离羟基绑定到间隔片段。间隔被插入到阵列中，两侧围绕第一个CRISPR重复的互补单链。这些被DNA聚合酶修复成双链重复，在染色体中产生一个新的两侧重复间隔，被转录加工成一个可以抵御之后的互补两侧PAM序列的入侵的crRNA。

细菌生理学方向Cas9的

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