外泌体分离技术的进展外文翻译资料

 2022-08-09 16:33:28

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外泌体分离技术的进展

摘要

外泌体是大多数类型的细胞分泌到细胞外空间的一种膜囊泡。除了执行许多生物学功能外（尤其是在细胞与细胞之间的交流中），大量证据还表明，外泌体中的几种生物分子（例如蛋白质和小RNA）与大多数人类恶性肿瘤的发病机理密切相关，它们可以作为疾病诊断，预后和治疗有效的生物靶标。这些推动了简单高效低廉地分离外泌体技术地发展。利用外泌体的物理化学和生化特性，已开发出许多分离外泌体的技术。本文总结了外泌体分离技术的进展，重点介绍了它们的分离机制，分离效率，挑战和前景。我们希望通过概述外泌体分离技术，开辟新的视角，研究出更具创新性的方法和设备，以便能从从更多的生物基质中短时间内高效低廉地分离外泌体。

关键词：外泌体，隔离

1.介绍

外泌体的发现可以追溯到1983年，分别在由Harding和Pan等人发表的两篇论文中介绍，随后又Pan等人确认其存在。在这些论文中，作者培养了未成熟的红细胞——带有标记转铁蛋白受体的网状细胞，以追踪转铁蛋白受体从质膜运动进入网状细胞。出人意料的是，观察到标记的转铁蛋白受体被网织红胞内化，然后重新包装在其内部的小囊泡（〜50nm）中。这些囊泡最初被认为是存在于细胞外的，然后被运到溶酶体中破坏，随后从成熟的血网状细胞中分泌到细胞外的空间中。后来，在1989年，Johnstone等人将其称为细胞外囊泡。外泌体属于膜外囊泡的大家族中的一种，膜囊泡的大家族通常包括微囊泡（100-350nm），凋亡小泡（500-1000nm）和外泌体（30-150nm）。这些细胞外囊泡被认为与许多生物过程有关，并且在细胞间的通讯中占有重要地位。它们的病理生理作用表现在包括癌症在内的各种医学状况和疾病中。当在电子显微镜下观察时，外泌体显示出特征性的杯状形态，表现为直径范围为30至150nm的扁平球（图1）。杯状形态很可能是由于在电子显微镜的样品制备过程，外泌体极度脱水，从而导致外泌体破坏。相比之下，在低温电子显微镜下，外泌体仍保持完全水合，观察到圆形形态。图1也显示了典型外泌体的示意图。

如图1所示，外泌体具有特征性的脂质双层，其平均厚度为 5nm。外泌体的脂质成分包括神经酰胺（有时用于将外泌体与溶酶体区分开来），胆固醇，鞘脂和甘油三酸酯和饱和的脂肪酰基链。外泌体的外表面富含糖链，例如甘露糖，聚乳糖胺，alpha;-2,6唾液酸和N-连接的聚糖。

有趣的是，在外泌体的表面和内部发现了蛋白质。作为外泌体携带的最重要的货物之一，蛋白质可以提供与外泌体亲代细胞生理状态相关的宝贵信息。许多外泌体都包含所有外泌体中常见的蛋白质，无论分泌它们的细胞类型如何，而只有一小部分蛋白质是细胞特异性的，这一小部分蛋白质反映了这些分泌细胞的类型和病理生理状况。外泌体包括血小板有关的生长因子受体、乳粘附素、跨膜蛋白、和溶酶体相关的膜蛋白、膜转运蛋白和膜融合蛋白（如膜联蛋白，弗洛林素，G蛋白偶联受体，热休克蛋白，四跨膜蛋白，参与多囊体生物发生的蛋白以及脂质相关蛋白和磷脂酶）。因此，这些特征蛋白可作为外泌体分离和定量的良好生物靶标。外泌体携带的另一种重要货物是核酸，包括脱氧核酸（DNA），编码和非编码核糖核酸（RNA）（例如信使RNA（mRNA）和小RNA（miRNA））。这些核酸通常需要在准确分离外泌体后进行定量，因为它们精确地反映了多种临床症状和相关疾病。

近年来，由于外泌体的生物学意义实际上反映了其亲代细胞的状况，因此外泌体受到了极大的关注。尽管外泌体的确切生物学功能仍有待充分研究，但越来越多的证据表明外泌体在许多细胞过程中起着至关重要的作用，例如细胞间通讯，凝血，抗原呈递，废物处理以及蛋白质和核酸的转移。尽管三年前就发现了外泌体，但研究人员才刚刚开始揭开这些极小的细胞外囊泡的奥秘。外泌体最初被认为是死亡细胞的实验伪像，废物或遗体，现在被认为是新形式的细胞-细胞通讯的核心部分。细胞-细胞通讯在所有多细胞生物中都是至关重要的，以前细胞通讯被认为只能通过接触依赖性（相邻细胞之间的直接接触），旁分泌（短程信号分子与附近细胞的受体结合），内分泌（远距离激素通过血流与受体结合）或神经元（沿着神经元传播的电信号）实现。最近的研究强调了外泌体介导的细胞间通讯的许多过程，例如免疫信号传导、血管生成、衰老、增殖、分化，并涉及许多人类疾病，例如神经退行性疾病、癌症和艾滋病。更重要的是，越来越多的证据表明，外泌体在调节血管生成，免疫的过程中也起着关键作用。体液和血液中的循环外泌体极有可能成为无创或微创生物靶标，可用于各种类型癌症的早期诊断和预后。因此，外泌体不仅有助于加深对细胞生理学和病理学的了解，而且具有转化为各种临床应用的巨大潜力（包括从诊断、预后到核酸递送、癌症治疗）。

对外泌体及其生物学功能的研究的快速发展已从根本上提供了对外泌体所发挥的生理作用及其与人体健康的相关的新见解。因此，外泌体的分离和定量化已成为一项重要技术。 外泌体是改善人类健康的第一步，因为它们目前已用于生物靶标的测试，所以必须可靠、有效地从复杂的生物基质（如血液，尿液和脑脊液）中分离外泌体。迄今为止，已经开发出五种外泌体分离技术。它们分别是基于差异超速离心技术，基于尺寸大小的分离技术，免疫亲和力捕获的技术，外泌体沉淀和微流控的技术。在以下部分中，我们将总结五种技术，并通过典型示例说明其机理和典型的外泌体分离工作流程，对各种外泌体分离技术进行严格的比较，并在结语之前讨论该领域的主要挑战和前景。

2.外泌体分离技术

为了促进这些独特的细胞外囊泡的研究和应用，至关重要的是，应从多种细胞碎片和干扰成分中特异性分离外泌体。用于分离外泌体的技术应高效，并能够从各种样品基质中分离出外泌体。为了检测分离的外泌体，已经开发了几种光学和非光学技术来测量其大小，大小分布，形态，数量和生化成分。随着科学技术的飞速发展，已经有许多技术被应用。为分离外泌体而开发的产品，提取分离的数量和纯度都很可观。每种技术都利用外泌体的特定特征，例如它们的密度，形状，大小和表面蛋白来辅助它们的分离。每种技术的不同也为外泌体分离带来了独特的优缺点。这些外泌体分离技术将在以下各节中详细讨论。

2.1 基于超速离心的分离技术

当异质混合物（悬浮液）受到离心力-离心作用时，悬浮液中的颗粒成分将根据其密度，大小和形状而沉降。较稠密和/或较大的颗粒先沉降出来。离心通常用于分离和纯化颗粒物质，以及分析包括生物聚合物（如核酸和蛋白质）在内的高分子材料的流体动力学特性。取决于所施加的离心力，悬浮液中的颗粒可以根据它们的物理性质以及溶剂的密度和粘度分离。超速离心是为产生高达1,000,000times;g的极高离心力而优化的离心过程。超速离心有两种类型：分析型和制备型超速离心。分析超离心用于研究颗粒材料的物理化学性质和聚合物材料的分子相互作用。对于外泌体分离，制备型超速离心起着重要的作用，因为它旨在分离小的生物颗粒，例如病毒，细菌，亚细胞器和细胞外囊泡。基于超速离心的外泌体分离被认为是金标准，并且是外泌体分离中最常用和报道的技术之一。据估计，超速离心技术在外泌体研究用户使用的所有外泌体分离技术中占56％。这种方法通常被许多人认为易于使用，需要很少的技术专业知识，并且随着时间的流逝价格可承受（例如，一台超速离心机（用于长期使用），并且只需很少或无需样品预处理即可适度耗时。由于这些原因，基于超速离心的技术已成为外泌体研究人员中比较流行的选择。制备型超速离心有两种类型：差速超速离心和密度梯度超速离心。

通过差异超速离心分离外泌体通常包括一系列不同离心力和持续时间的离心循环，以根据它们与样品中其他成分的密度和大小差异来分离外泌体。对于超速离 心，通常使用的离心力范围为100,000至120,000times;g。在隔离开始之前，通常需要执行清洁步骤进行人类血浆/血清去除样品中的大生物颗粒，并向样品中掺入蛋白酶抑制剂以防止外泌体蛋白质降解。在外泌体分离过程中，吸出上清液并取决于离心力使用时，将上清液或沉淀重新悬浮在适当的介质（如磷酸盐缓冲盐水（PBS））中，并随后以增加的离心力进行离心操作。最后，分离出的外泌体再次重悬并储存在-80°C直至进一步分析。这种分离外泌体的方法也称为制粒法或简单的超速离心法。图2给出了差异超速离心的工作流程示意图。

密度梯度超速离心有两种类型，即等速超速离心和移动区超速离心。密度梯度超速离心在分离外泌体（如外泌体）中已变得越来越普遍。在密度梯度超速离心中，外泌体的分离是根据其大小，质量和密度在离心管中预先构建的密度梯度介质中进行的，密度从底部到顶部逐渐降低。将样品以窄带形式铺在密度梯度介质的顶部，并进行扩展的超速离心。在施加离心力时，样品中包括外泌体的溶质会以单个区域的密度通过各自的特定沉降速率，通过密度梯度介质朝底部移动，从而导致离散的溶质区域。然后可以通过简单的馏分收集方便地回收分离的外泌体。虽然连续梯度用于分析应用，不连续梯度（阶梯式梯度）更适合于制备目的，其中分离的外泌体位于密度梯度层的界面，从而极大地促进了它们的收获。与差速超速离心不同，密度梯度超速离心的缺点是其能力在很大程度上受狭窄的负荷区限制。

在等温超速离心中，将包含样品中溶质的整个密度范围的密度梯度介质加载到离心管中。外泌体与其他溶质的分离仅取决于它们与所有其他溶质的密度差，前提是要进行足够的离心时间。在离心过程中，外泌体沿密度梯度介质沉降至密度与等密度位置相同的密度。外泌体到达等渗位置后，离心力将外泌体进一步聚焦到一个尖锐的区域，并在该区域内保持它们的存在，这表明等渗超速离心是静态的。或者，在自生梯度材料（例如氯化铯）的情况下，可以将含有外泌体的样品与梯度介质均匀混合。在离心过程中，外泌体移至等渗位置，同时生成氯化铯的密度梯度。然后可以将外泌体从1.10至1.21 g / ml的目标密度区域中提取出来，然后将其浓缩。然后将取自目标密度区域的等分试样以 100,000times;g进行短暂的超速离心，得到将纯的外泌体沉淀重新悬浮在PBS中以进行进一步研究。

在移动区超速离心中，将含有外泌体的样品作为薄区装在梯度密度介质的顶部，该梯度密度介质的密度低于任何溶质的密度。与等渗超速离心不同，外泌体的分离仅取决于它们与所有其他溶质的密度差，样品中的外泌体是根据其大小和质量而不是密度进行分离的。这样可以分离具有相似密度但大小不同的细胞外囊泡。因为包括外泌体在内的溶质的密度大于梯度培养基的密度，所以移动区超速离心是动态的，而不是静态的。换句话说，当长时间进行离心分离时，所有溶质最终都会在离心管底部沉淀。因此，必须仔细优化离心时间。另外，为防止外泌体沉淀出来，通常在离心管底部铺一层高密度垫。相反，在等温超速离心中，无论离心持续时间长短，外泌体都不会沉淀到离心管底部。

由于外泌体的异质性和细胞外囊泡大小的显着重叠，差异超速离心常会受到污染和外泌体损失。超速离心通常与等密度或运动区技术相结合，以使密度相对较低的外泌体漂浮并进一步纯化外泌体。已知该技术能够提高分离的外泌体的数量。表征后，将含有外泌体的目标馏分在PBS中稀释，并在90℃下进行另一轮超速离心100,000g可得到纯净的外泌体，以供进一步分析。

2.2 基于大小的隔离技术

超滤是一种流行的基于大小的外泌体分离技术。超滤的基本原理与常规膜过滤没有什么不同，在常规膜过滤中，悬浮颗粒或聚合物的分离主要取决于它们的大小或分子量。因此，根据其大小，可以使用具有确定的分子量或大小排除极限的膜滤器分离外泌体。超滤比超速离心更快，不需要特殊设备。但是，使用剪切力可能会导致大囊泡的变形和破裂，进而可能会扭曲下游分析的结果。

短时间离心的纳米膜浓缩器已被证明能够可以快速富集尿液外泌体，就像超速离心一样。已证明，成功分离出仅0.5 mL的尿液就足够了。为证实外泌体分离的成功，采用蛋白质印迹法检测外泌体生物靶标，并采用电子显微镜检查外泌体的典型特征。纳米膜浓缩器具有帮助诊断肾脏疾病的潜力。

对于尿，血清，脑脊液和细胞培养基等无细胞样品，已开发出一种用于从已隔离和分离的外泌体中提取RNA的商业外泌体分离试剂盒。试剂盒利用了基于注射过滤器的快速分离技术捕获外泌体和其他细胞外囊泡的过程。注射器过滤器中串联配置了两个膜，这样当样品通过两个膜时，外泌体被捕获在下膜上，而较大的细胞外囊泡（如凋亡小体和微囊）则保留在上膜上。当捕获的外泌体通过使RNA提取混合物穿过下膜而被裂解时，外泌体所携带的RNA被释放。随后，通过定量实时逆转录酶-聚合酶链反应（qRT-PCR）完成miRNA检测和表达谱分析。与超速离心和外泌体沉淀相比，超滤法提取尿液中的体外核糖体RNA产量最高（通过荧光染色定量）。

如图3所示，应用顺序过滤从细胞培养上清液中分离外泌体。首先，死角（正常）过滤使用100 nm膜滤器过滤掉悬浮的细胞和大细胞碎片。其次，将滤液用截留分子量为500 kDa（MWCO）的中空纤维进行切向流过滤。然后将浓缩的渗余物渗滤以进一步去除污染物。最后，用100nm径迹蚀刻滤光片过滤样品。为了最大程度地提高外泌体回收率，在每个步骤结束时都要清洗滤膜，并在第二和第三步期间监测并维持跨膜压力。最后，电子显微镜验证了形态，质谱证实了外泌体相关蛋白的存在。顺序过滤允许以低操作力分离具有高纯度和功能完整性的外泌体。例如，切向流过滤结合氘/蔗糖基密度梯度超速离心用于分离治疗性外泌体已进行临床试验。其速度，自动化和可扩展性可能促进外泌体研究和应用从实验台到床旁的转化。在第一阶段临床试验中，观察到树突状细胞培养物中的外泌体促进了T细胞对肿瘤排斥的反应。

应用于外泌体分离的另一种基于大小的分离技术是尺寸排阻色谱法（SEC）。在SEC中，多孔固定相根据大分子和颗粒的大小进行分类。具有较小流体动力学半径的样品中的组分能够通过孔，从而导致较晚的洗脱。包括外泌体在内的具有较大流体动力学半径的成分不进入孔中。例如，通过尺寸排阻分离法分离间充质干细胞条件培养基中的外泌体。间充质干细胞通过分泌外泌体介导心肌缺血/再灌注损

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