裸氧化铁磁性纳米粒子一步纯化组氨酸标签蛋白外文翻译资料

 2022-08-09 16:39:01

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裸氧化铁磁性纳米粒子一步纯化组氨酸标签蛋白

摘要

在下游加工中，磁选是一种很有前途的替代传统方法的方法。其拥有更容易处理、更少的处理步骤和更可持续的过程的优势。通过具有高梯度磁性捕捞（HGMF）的磁性纳米吸附剂，可以一步从粗细胞裂解物中直接提取目标材料。此外，可通过减少下游加工步骤避免使用危险消耗品。在这里，我们提出了一种一步磁性捕鱼的原理，从粗大肠杆菌细胞裂解液提取附加有六组氨酸（His6）标签的绿色荧光蛋白（GFP），它被经常用作模型目标分子。这项研究的目的是创建一个一升规模的磁性捕鱼的流程，其中纯度91%的GFP可以由一个单一的纯化步骤从清除的细胞裂解液获得。通过His6标签的结合可以被证明，因为没有标记的GFP与裸露的氧化铁纳米粒子（BIONs）没有显著的结合。非功能化的BIONs的主要粒子直径约为12nm，可用于该过程，可以用简单和低成本的共沉淀法合成。因此，带有BIONs的HGMF可能为下游加工的新的、更绿色的时代铺平道路。

简介

在自然界中，生物分子和无机表面之间存在着各种各样的相互作用，从海底生物的粘附到脊椎动物骨骼和牙齿的生长都存在着。这些相互作用可以用来实现纳米医学在植入物上涂层、药物传递或磁共振成像中的应用。此外，在对相互作用的基本理解的帮助下，出现了新的应用领域，如生物传感、生物催化、和储能到废水处理、毒理学，以及治疗蛋白的纯化等。为了研究这些生物界面现象，需要对表面的结合过程、影响相互作用的参数和蛋白质组织进行彻底的表征。在生物-纳米界面上有多种可能的方法来研究、解释相互作用。所有方法的主要问题是复杂生物流体中许多不同力和组分的相互作用，它们控制着生物分子与纳米材料之间的相互作用。在复杂的流体中，组分（从小分子到大蛋白）定义了纳米粒子的表面。这一动态概念被称为日冕形成，它立即发生在生物介质中。生物分子松散地与表面结合，其组成由生物分子的发生率和密切关系决定。特别是，超顺磁性纳米粒子是非常令人感兴趣的，因为它们的磁性有助于生物分子的传输和磁传感，以及磁致加热。因此，许多应用，特别是在医疗部门开始浮现出这些磁性纳米材料。然而，它们的性质可用于生物技术、催化和数据存储。控制磁性纳米粒子与生物分子相互作用的一种方法是通过不同的修饰和功能化方法对粒子表面进行改性。这种粒子的调谐不仅影响了水界面，从而影响了与生物分子的相互作用，而且还改变了粒子在悬浮液中的稳定性，从而改变了其力学性能。因此，控制纳米技术的表面特性是纳米技术面临的最大挑战，因为不仅表面修饰，而且在复杂介质中的缓冲成分以及洗涤剂和生物分子也决定了纳米颗粒的特性。另一个难以控制的方面是纳米颗粒在复杂介质中暴露于生物分子时的团聚行为。然而，团聚强烈影响流体力学性能以及磁性纳米颗粒流体的机械和磁性处理能力。低成本的磁性纳米颗粒，通常由磁铁矿、磁铁矿、中间的过渡态或两种材料的混合物组成，必须小于20 - 30纳米，才能具有超顺磁性，因为在室温下没有剩磁，所以易于分离。

尽管与标准工艺相比，磁分离具有许多优点，并且已经用于医疗应用，但到目前为止还没有工业工艺。

另一方面，有几种方法来设计和建造工业相关的高梯度磁捕捞（HGMF）分离器。模型有铁球或钢丝网钢丝棉。但是，特别是磁性纳米颗粒和目标分子的回收是一个关键的处理方面，可以用不同的方法来解决，包括两相流，超声波，或可移动矩阵如转子-定子的设置。在本研究中，我们使用了一种转子-定子HGMF来实现纳米颗粒的快速再分散和去团聚。一般来说，特别是小的氧化铁纳米颗粒在环境条件下和高盐浓度下容易聚集。这种效应在磁珠表面得到加强。因此，团聚体对磁性纳米颗粒的流体力学性能有积极的影响，从而提高了磁性纳米颗粒的分离效率。另一方面，聚集降低了纳米颗粒的有效表面积，胶体稳定性也因此成为HGMF的主要挑战。在这里，我们使用了完全非功能化的裸氧化铁纳米颗粒(BIONs)，如果不将分子稳定在pH值为5.5 - 8.5的范围内，它们在环境条件下的胶体稳定性不是很好，在微观尺度上形成了大的团聚体。这些颗粒被用作吸附剂来纯化绿色荧光蛋白(GFP)，其中包含一种六肽(His6)标签，通常用于亲和层析下游处理。在标签序列中，我们利用组氨酸侧链与纳米级氧化铁表面的亲和力，氧化铁表面由氢氧基连接的铁离子组成。与铁离子的配位和缓冲控制的静电相互作用导致了His标记蛋白的优先向吸附，这些蛋白可以随着磁珠被磁分离。进一步处理，这些蛋白可以通过类似于固定化金属亲和层析(IMAC)的洗脱缓冲液释放。IMAC是一种用于工业和实验室规模的常规工艺，用于纯化几种蛋白质。金属离子与附着在色谱树脂上的配体螯合。因此，His-标记与螯合离子相互作用，形成可逆的配位键。因此，磁珠可用于亲和蛋白纯化。一些研究小组已经将IMAC原理应用于磁选过程。然而，研究是基于磁性微粒，是功能化的链接螯合金属离子。虽然His标记蛋白分离的原理与IMAC相似，但我们想强调的是，我们的颗粒是作为没有表面修饰的裸纳米颗粒使用的。在我们的过程中，标签通过络合作用和静电作用与粒子表面相互作用。然而，水界面上的铁离子与生物分子紧密结合，因此不会渗漏。因此，既不需要昂贵的络合剂，也不需要有毒的金属离子，因为这里介绍的过程不需要再生。我们关注的是与工业相关的HGMF的升级，并能够通过升级的磁选试验工厂验证升级。

结果与讨论

共沉淀合成的BIONs的性质在我们小组的研究中早些时候均被报道。通过透射电子显微镜（TEM）测量（图S1），BIONs的粒径分布在12nm左右。非功能化纳米粒子的小尺寸导致了比表面积高达89 m2 gminus;1，超顺磁性(剩磁lt; 1 emu)和高饱，磁化强度为83 emu gminus;1。氧化物纳米粒子的两亲性通过Zeta电位来证明，Zeta电位在pH6.5-7时带负电荷，在等电点以下带正电荷。通过拉曼光谱和X射线衍射（XRD）测量，可以将颗粒识别为磁铁矿（图S1和S2）。

在大肠杆菌BL21（DE3）中表达的His6-GFP在细胞裂解后用阴离子交换色谱（AEX）纯化。然后用固定金属亲和层析进行进一步纯化。在进一步使用His6-GFP（图S3、S5和表S4）之前，获得了纯度gt;99.9%的 His6-GFP（图S3、S5和表S4）。

纯His6-GFP和BION的吸附等温线如图1A所示.有趣的是，所有的缓冲条件都导致了His6-GFP的吸附，并且在0.25gg-1左右具有相似的结合能力。因此，类似的表面覆盖率约为40%（表S6）。然而，亲和力可以通过缓冲液的变化来调节。高亲和力，以低KD值表示。可观察到乙酸（0.01gL-1），Tris缓冲盐水（TBS，0.01gL-1）和Tris（羟甲基）-氨基甲烷（Tris，0.03gL-1），除了磷酸根离子对氧化铁的表面络合作用外，这种效应通常归因于溶剂和缓冲离子对表面张力的变化。另一个有趣的观察是没有标签的参考GFP的吸附，它不倾向于在Tris缓冲液中吸附，清楚地表明了缓冲液对独立的His6序列结合的贡献（图1）。非标记蛋白的结合能力（0.07gg-1）明显低于His6标记蛋白。因此，BIONs周围缓冲液组成的变化可以用来影响His6标记蛋白的结合亲和力，从而控制分离过程。蛋白质在纳米粒子上的最大负载可以很容易地与金属离子化纳米材料和色谱树脂竞争。即使是His6标记的GFP与BION表面的亲和力也与Ni2 固定化材料的亲和力相似。蛋白质与胶体相互作用的另一个有趣的点是团聚行为。在大多数缓冲系统中，未涂覆的BIONs显示出在环境条件下团聚的趋势。尽管纳米粒子形成10mu;m团聚，我们依然获得了这种高结合能力的His6-GFP。这意味着蛋白质能够扩散到松散结合的团聚体中，并与单个颗粒或更小的团聚体结合。在早期的一项研究中，我们观察到含有不同标记的GFP与BIONs具有小角度中子散射的类似行为。因此，这些团聚提供了纳米粒子和微粒的优势。与较大的团聚体相比，在100nm以下流体动力学直径的差速离心沉降和光学离心过程中，这种行为也是可见的，这可以通过动态光散射来观察（图S7）。虽然这些颗粒表现出小颗粒的高比表面积，但它们的流体力学性质与大颗粒相似，导致在高梯度磁捕渔过程中快速分离。此外，His6-GFP的结合能力不受复杂介质的影响，如大肠杆菌发酵液中的裂解液（图1B）。对于清除的细胞裂解液，His6-GFP与BION表面的高亲和力仍然很高，细胞碎片在与纳米粒子孵育之前被过滤。在此，在相同的缓冲液条件下（50mm Tris缓冲液，pH7），也可以达到中等较高的结合能力（0.33gg-1）。这种微小的差异可以通过改善纳米粒子在复杂悬浮液、蛋白质-蛋白质相互作用和共吸附过程中的可达性来解释。在仍含有细胞碎片的裂解液中，也可以观察到BION对His6-GFP的吸附，尽管其亲和力较低。在这里，可以达到与BIONs相同的吸附能力，就像纯His6-GFP一样。然而，磁性纳米粒子与不同生物体的细胞壁具有很高的亲和力。因此，我们的吸附实验表明，His6-GFP选择性地结合到BION表面，这是有效分离过程的基础。

对于纯化过程，目标分子的回收往往比分离困难，对时间敏感，因此应该彻底研究。因此，我们比较了不同的洗脱的可能性。由于结合应主要通过组氨酸标签，一种合理的洗脱可能性是通过pH值的变化来改变静电性质，从而使表面或组氨酸标签去质子化或质子化。另一种策略是用咪唑分子取代组氨酸亚基为铁离子的配位键，并通过引入钠和氯离子获得更高的离子强度来削弱静电相互作用。咪唑通常被用作洗脱剂，通过取代组氨酸侧链，因为与金属离子类似的配位，用于IMAC中His标签蛋白的纯化。因此，比较了几种以不同咪唑浓度为重点的缓冲液的洗脱能力，并在图2中进行了总结。在pH7的Tris缓冲液中进行His6-GFP与BIONs的孵育，pH向pH9或5的移动导致两个完全不同的结果。虽然随着pH向基本环境转移大约60%的先前吸附的GFP被洗脱，但没有观察到蛋白质洗脱的pH向酸性区域转移。所以His6-GFP与BIONs亲和力最低的缓冲液在这里进行调查，有轻微的pH变化的磷酸盐缓冲盐水（PBS）也导致约65%的His6-GFP在孵育过程中与BIONs结合。使用含有NaCl和咪唑的磷酸盐缓冲液的普通IMAC洗脱缓冲液，可以观察到略高的解吸率。然而，咪唑的量并不影响脱附浓度从500至50mm下降。结果表明，巧妙地操纵系统的静电特性可以导致稳定的结合蛋白或与未结合蛋白的洗脱。考虑到His6-GFP的高结合能力和磁性纳米粒子的比表面积，很少有空间留给大细胞碎片也结合到BION表面。

蛋白质在复杂介质中对纳米粒子的吸附通常是一个非常快速的过程，并且在几秒钟后建立了第一表面层。从我们的观察来看，His6-GFP的行为甚至考虑到BION的聚集，因此不能观察到扩散限制。然而，由于吸附和解吸的驱动力不同，解吸过程所需的时间跨度通常比吸附所需的时间长。在这里，His6-GFP解吸监测超过1天（图3）。对于与BIONs结合的His-GFP，与IMAC洗脱缓冲液孵育可立即解吸（30s）约10%的蛋白质。孵育5分钟后，约30%的蛋白质可被解吸，并在上清液中发现。随着孵育时间的增加，未结合GFP的数量增加。效果会随着时间的推移而减弱，即使没有在3h后可观察到洗脱最大值的稳定性。大多数His6-GFP在30分钟后已经被解吸，大约70%在一小时后被解吸，24小时后最大洗脱效率为78%（图3A）。同样的行为可以观察到纯化的His6-GFP结合到BIONs和含His6-GFP的清除细胞裂解液结合在蛋白质电晕周围的BIONs（图3B）。这种强烈的时间依赖性解吸行为的可能解释是吸附和洗脱的不同扩散行为以及不同的吸附和解吸动力学。有趣的是，在洗脱过程中，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）没有观察到其他蛋白质，即使His6-GFP在27.8kDa只占清除裂解液中蛋白质的30%（图4A）。此外，在洗脱组分中没有见到GFP二聚体，这是从IMA C柱中回收蛋白质后的情况。荧光显微镜也可以直观地看到组氨酸标签GFP和BIONs结合（图4B，C）。在这里，第二步洗脱可以观察到轻微的下降，而只有少量的荧光成分可以检测到后，用IMAC缓冲液（图4D）。对于无标记GFP的过程，荧光显微镜和SDS-PAGE检测不到结合（图4E和S8）。然而，虽然大部分蛋白质可以被回收，但有些His6-GFP在洗涤过程中丢失，有些His6-GFP即使在两个洗脱步骤中也保持结合（图4F）。此外，在细胞裂解蛋白的SDS-PAGE中，第2个条带在35kda左右出现，而IMAC缓冲液没有将其解吸。这种条带只出现在与His6-GFP裂解液孵育中，而不出现在未标记的GFP裂解液中。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法，可以鉴定外膜蛋白F (ompF)，它代表第二个波段。ompF的吸附可能与GFP的相似性有关，如beta;桶形状。此外，ompF含有许多天冬氨酸和谷氨酸亚基，它们大多位于蛋白质的末端或外周部位，已知它们与氧化铁纳米粒子很好地结合。这两种裂解物来源于相同的大肠杆菌菌株，在洗脱组分中无法检测到这一物种。因此，这个蛋白带很可能是His6-GFP和其他较小蛋白质的化合物，这意味着与其他蛋白质的共吸附实际上可能改善His6-GFP的分离和恢复。

低成本BIONs对商业上可用的亲和标签的简单应用引起了我们的兴趣，我们试图用该系统实现大规模的净化过程。分离过程采用转子-定子分离器（26转子和25定子板）。高梯度磁捕捞过程的足够磁场是由电磁铁产生的（图S9）。由磁铁感应到高达0.6T的磁通，这与类似的HGMF结构很好地吻合。一升清除裂解液（1gL-1His6-GFP）与1LBION s（5.5gL-1）混合，然后在HGMF中试分离器中处理（图5A）。将颗粒和结合蛋白从上清液中磁分离，然后在2L结合缓冲液（50mM Tris缓冲液pH7）中重新分散，进行两个洗涤步骤。选择含有蛋白质的裂解液和BIONs的浓度与实验室规模的实验相当，以确保

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