羧甲基壳聚糖纳米粒固定化DspB提高其稳定性和抗菌活性外文翻译资料

 2022-08-12 15:46:34

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羧甲基壳聚糖纳米粒固定化DspB提高其稳定性和抗菌活性

摘要：

beta;-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶（DspB）来源于集食放线放线菌CU1000，并可以抑制和分散由表皮葡萄球菌，金黄色葡萄球菌和放线菌形成的生物膜。但是，该酶在应用上受到其稳定性差的限制，本研究从放线菌HK1651克隆了一种beta;-N-乙酰氨基葡糖苷酶编码基因dspB，并在大肠杆菌中表达。将重组DspB加载到一种水凝胶纳米颗粒上，该纳米颗粒是使用亚油酸（LA）修饰的羧甲基壳聚糖（CMCS）超声处理后制备的。在0.3 mg / ml的DspB中纳米颗粒几乎达到饱和，负载率为76.7％。固定化显著增强了DspB的热稳定性，存储稳定性和可重复使用性。而且，由于双重机理，固定化还增加了抗生物膜活性，包括酶稳定性和CMCS纳米颗粒的抗生物膜活性。

1.简介

生物膜是包裹在复杂的高分子外基质（EPS）中的粘附微生物的结构化、专门化群落。EPS能够提供机械支撑作用，介导细胞间以及细胞与表面间的相互作用，并起到保护的作用。生物膜中的细菌细胞对多种抗生素的敏感性比浮游细菌低1000倍。因此，医疗设备（例如植入体表面）上形成的生物膜会大大增加感染的风险。

成熟的生物膜很难通过化学方法（抗菌剂）或物理方法（加热，超声处理或涡旋）去除。最近，使用酶破坏EPS去除生物膜已经成为控制和去除生物膜的一种有吸引力的策略。已从聚合放线杆菌CU1000（以前称为放线放线杆菌CU1000）中鉴定出beta;-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶DspB，它降解了聚-beta;-（1,6）-N-乙酰-葡萄糖胺（PNAG），表皮葡萄球菌，金黄色葡萄球菌和放线放线杆菌的EPS中的主要多糖。已经显示，DspB可以引起由几种细菌形成的生物膜的分解和分离。然而，这种酶的应用受到其性质不稳定的限制。

固定化酶通常可以大大提高稳定性和可重复使用性，因此引起了越来越多的关注。壳聚糖及其衍生物可通过自聚集作用在水中形成水凝胶纳米颗粒，因为其比表面积较高，可装载大量酶，无毒且生物相容性高，是最适合酶固定化的基质之一。此外，壳聚糖及其一些衍生物的抗生物膜活性也得到了很好的证明。我们之前的研究显示壳聚糖衍生物羧甲基壳聚糖（CMCS）可以通过双重机制抑制生物膜的形成，包括通过电荷中和进行聚集和通过桥接机制进行絮凝。

在这项研究中，来自放线放线杆菌HK1651的DspB被固定在CMCS纳米颗粒上，然后探究固定化酶的热稳定性，储存稳定性和可重复使用性，并将其与游离酶进行比较。此外还研究了固定化酶对金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌和放线杆菌的抗生物膜作用，并探讨了潜在的机制。

2.材料与方法

2.1 细菌菌株，培养基和试剂

本研究使用的细菌菌株为金黄色葡萄球菌RN6390、15981、8325和上皮表皮葡萄球菌QY301、RP62A、M187和1457，放线菌HK1651。这些菌株37°C条件下在大豆蛋白胨培养基（TSB）中培养。

奥多芬化学公司（中国南京）的CMC（脱乙酰度=90%，粘度=80 mPa·s）。基于1 H NMR光谱进一步计算出的O-羧甲基化度为89％。亚油酸（LA），1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙醇） 碳化二亚胺（EDC）和4-硝基苯基-N-乙酰基beta;-D-氨基葡萄糖是从西格玛化学公司购买的。本研究中使用的其他化学品为分析级化学品。

2.2 DspB的表达和纯化

为了表达DspB蛋白，设计引物pDspB-F：5rsquo;-GGAATTCCATATGAATTGTTGCGTAAAAGG (Nde I位点下划线)和pDspB-R：5rsquo;-CCGCTCGAGCTCATCCCCATTCGTCTTAT(Xho I位点下划线)， 以放线菌基因组DNA HK1651为模板，扩增dspB基因。从琼脂糖凝胶中纯化出预期的1.1 kb PCR产物，用Nde I和Xho I酶切，并连接进类似酶切的pET-24a( )。将得到的pET-24a-DspB转化进入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞。

在37℃配置含卡那霉素(30 mu;g/ml)的LB培养基，在其中培养含有质粒pET-24a-DspB的大肠杆菌BL21 (DE3)细胞，培养至600 nm处的光密度约为0.5，然后添加异丙基-beta;-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）到终浓度为0.2mM。在25℃条件下再培养24小时,离心收集(6000 gtimes;10分钟)细胞,用缓冲液(20mM磷酸盐缓冲剂，pH7.0，500mM氯化钠)重悬,然后用超声破碎法破碎。离心后(10000 gtimes;30分钟)，将上清液上样至亲和柱（HisTrap HP 5 ml，GE health），并通过在缓冲液A中的咪唑（5-500 mM）线性梯度洗脱。合并含有beta;-1,6-N乙酰氨基葡糖苷酶活性的级分，用磷酸盐缓冲液（20 mM，pH 6.0）透析，并保存在minus;20℃。如Laemmli所述，进行SDS-PAGE以检测纯化的酶。使用牛血清白蛋白作为标准蛋白，使用BCA蛋白测定试剂（美国皮尔斯生物技术公司）确定蛋白浓度。

2.3 酶活性测定

以4-硝基苯-N-乙酰基-beta;-D-氨基葡萄糖为底物，测定了游离和固定化DspB的活性。将10微升DspB加入0.2 ml底物溶液中[5mm底物置于含100mm NaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)中]，在40℃中孵育10min，加入10M NaOH的5mu;l终止反应。用405 nm分光光度计测定了对硝基苯酚增加的量。一个单位(U)的酶活性被定义为在上述条件下每分钟产生1 mol对硝基酚的酶量。

2.4 DspB在LA-CMCS纳米颗粒上的固定化

如之前的研究所述，使用LA修饰的CMCS制备水凝胶纳米颗粒。将DspB加入1 ml纳米颗粒(0.20 mg/ml)中，最终浓度为0.05-0.40 mg/ml，然后对悬浮液进行超声处理。采用离心过滤装置(分子量截止50kDa，密理博)超滤得到固定化酶。收集滤液(未固定的DspB)计算蛋白残留量。计算纳米粒子的DspB负载能力(LC)和DspB负载效率(LE)，计算公式如下：

A=添加的DspB总量；B=卸载的DspB总量；C =冻干后测得的纳米颗粒的重量。

在单独的实验中进行了一式三份的检测。本研究收集的数据用均数plusmn;标准差(SD)表示。

2.5 温度和pH对游离酶和固定化酶的影响

通过在磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中于20℃至80℃的温度范围内进行酶活性测定，确定了游离酶和固定化酶活性的最佳温度。在标准测定条件下，在各种缓冲液（50 mM）下，标准测定条件下，在40°C下测定pH对游离和固定化酶活性的影响：柠檬酸缓冲液（pH 4.0-5.6），磷酸盐缓冲液（pH 5.6-8.0）。所有测定至少一式三份进行。

2.6 游离酶和固定化酶的稳定性和可重复使用性

游离的和固定化DspB的热稳定性通过在pH 6.0的各种温度下孵育1小时后测量DspB的残留活性来研究。游离和固定化的DspB的储存稳定性通过在37℃下储存不同时间后测量残留活性来研究。在重复的催化过程中确定了固定化的DspB的可重用性，每次反应后，用过的酶用磷酸盐缓冲液（pH 6.0）洗涤以备下次使用，然后添加到底物溶液中开始新的反应。将每次重复发现的活性与假设100％的初始活性进行比较。

2.7 生物膜试验

如前所述，在96孔细胞培养板中形成生物膜。简而言之，将过夜培养的细菌稀释至1times;106菌落形成单位(CFU)/ml。每个孔(Coster，剑桥，麻州，美国)都装入100 mu;l稀释的液体。在37℃恒温静置培养24小时，0.9% (w/v) NaCl洗涤三次，用0.1% (w/v)结晶紫液150 mu;l染色30 min, 然后用0.9% (w/v) NaCl洗涤2次，30% (v/v)乙酸200 mu;l溶解15 min，提取生物膜固定的结晶紫。溶解液通过微量滴定板读数器测量其A590来确定生物膜的量。

在抑菌研究中，采用含有不同浓度DspB的TSB培养基稀释过夜培养的细菌。对于水解生物膜研究，使用不含DspB的 TSB培养基形成生物膜，然后以不同浓度的DspB处理1小时。每个样品至少重复六次，每个实验至少重复三次。

图1.纳米粒子的透射电子显微图。样品固定在铜网格上，室温干燥。用磷酸钨酸染色，透射电镜观察。

3.结果与讨论

3.1 DspB负载能力和效率的确定

通过透射电镜(TEM)观察了纳米颗粒的大小和形貌(图1)。TEM图像显示，纳米颗粒形状接近球形，表面光滑。纳米粒子的尺寸范围在100~500纳米之间。DspB的负载量和效率受其浓度的影响(表1)，随着DspB浓度在0.05-0.40 mg/ml范围内的增加，负载效率由79.25plusmn;1.50%下降到39.52plusmn;0.08%。另一方面，通过将DspB浓度从0.05提高到0.30 mg/ml, DspB的负载量从198.13plusmn;3.75 mg/g显著提高到767.08plusmn;13.90 mg/g。但是，DspB浓度从0.30 mg/ml增加到0.40 mg/ml负载量并没有显著增加，说明DspB在0.30 mg/ml时几乎饱和了纳米颗粒。当酶浓度足够高时，由固定在纳米颗粒表面的酶的固定数量是一定的，纳米颗粒几乎饱和。

3.2 温度和pH对游离和固定化DspB活性的影响

游离的和固定化的DspB的活性升高到40℃，然后随着温度的进一步升高而降低。游离和固定化的DspB的最佳温度为40℃（图2A）。两种酶形式的最佳pH均为pH 6.0（图2B）。因此，将DspB固定在CMCS纳米颗粒上不会改变其最佳温度和pH。

表1 固定量（LC）与固定效率（LE）

图2. 温度(A)和pH (B)对游离和固定化DspB活性的影响。游离（空心三角形）和固定（实心三角形）DspB的最佳温度是通过在50 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）中的各种温度（20–80℃）下测量活性来确定的。（B）通过测量50 mM柠檬酸缓冲液（pH 4.0-5.6；三角形），磷酸盐缓冲液（pH 5.6–8.0；圆圈）中40℃下的活性，确定游离的DspB的最佳pH（空心的三角形和圆形）和固定的DspB的最佳pH（实心的三角形和圆形）。新鲜的游离或固定化的DspB样品在pH 6.0和40℃下的酶活性定义为100％。

3.3 游离和固定化DspB的稳定性

3.3.1.游离和固定化DspB的热稳定性

图3为温度对pH 6.0下游离和固定化DspB稳定性的影响。在温度低于40℃时，自由和固定的DspB的活动都没有受到不利影响。残留活性在40℃以上时显著下降。然而，与游离酶相比，固定化的DspB在70℃孵育60min后失去的活性更少，保留了21.0%的初始活性，而游离的DspB几乎失去了所有的活性。

纳米颗粒固定化酶热稳定性的提高可能是因为一些酶分子被包裹在纳米颗粒的核心，这可以为酶分子提供更坚硬的外部骨架，并保护酶的结构不受热交换的扭曲或破坏。

图3. 游离的(空心三角形)和固定化的(实心三角形)DspB的热稳定性。该酶在不加底物的50 mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中分别放入0-70℃条件下孵育1小时。在40℃和pH 6.0条件下测量残留活性。以未孵育的酶活力为100%。

3.3.2.游离的和固定化DspB的储存稳定性

图4显示了游离的和固定的DspB在37℃下的储存稳定性。游离的DspB可以在较短的孵育时间内保持稳定，但在较长的孵育时间内会受到不利影响，在37℃的7小时内完全失去其活性。相反，固定的酶在7 h后保留了其初始活性的33.4％。这些结果表明固定化显着改善了酶的储存稳定性。

固定化酶稳定性的提高可能是由于DspB与纳米颗粒之间的多重相互作用(如电相互作用、氢键作用和疏水相互作用)所致。酶对环境非常敏感，容易失去活性，因此固定化酶的稳定性对于后续的应用，尤其是在体内的应用尤为重要。

图4. 游离的(空心三角形)和固定的(实心三角形)DspB的储存稳定性。该酶在不含底物的50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中分别在37℃条件下孵育不同的时间。残留活性在40℃和pH 6.0条件下测量。以未孵育的酶活力为100%。

3.3.3.固定化DspB的可重用性

由于DspB固定在CMCS纳米颗粒上对降低生产成本具有重要意义，因此也对其可重用性进行了研究。在8个水解循环后，固定化DspB的活性维持在原始活性的60%以上(图5)。固定化DspB活性的丧失可能是由于再利用过程中构象的变化或支架基质的泄漏。

从商业角度来看，酶的可重用性是固定化的重要特征之一。结果表明，固定化酶具有良好的操作稳定性。这种可重用性可以显著降低应用过程中的操作成本。此外，在纳米颗粒上固定化DspB可以应用于体内的医疗材料表面，防止生物膜的形成，从而大大拓宽了该酶的应用范围。

固定化效果在很大程度上取决于支架的性能。近年来，纳米技术在固定化酶的制备方面显示出重要的应用前景。纳米材料具有独特的物理化学和生物特性，如体积小、磁性和较大的表面积体积比，这使得它们有利于酶的固定化。酶在纳米颗粒上的固定化可以提高其对变性化合物的耐受性、对pH和温度的稳定性，以及为其重复使用提供适宜的环境。此外，热变性酶与纳米颗粒的络合作用完全可以阻止酶在加热过程中不可逆的聚集，其机理与分子伴侣类似。壳聚糖是一种极具吸引力的天然聚合物，具有较大的主胺基和正电荷。它表现出良好的生物相容性，对化学修饰的敏感性，以及增加膜渗透性的能力。此外，壳聚糖纳米颗粒易于制备，是最有前途的酶固定化载体材料之一。据报道，壳聚糖纳米颗粒固定化beta;-半乳糖苷酶的性能优于壳聚糖微、大颗粒固定化酶。这可能是由于壳聚糖纳米颗粒比表面积高，且具有大量固定酶分子的活性官能团

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