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滇池水华束丝藻毒素对斑马鱼形态学改变及肝乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶的抑制效应

摘要

水华束丝藻属蓝藻属，能够分泌被称为束丝藻毒素的神经毒素或麻痹性贝类毒素，通过全球水体富营养化而威胁环境安全和人类健康。虽然这种毒素的分子机制已经进行过研究，但仍有许多问题，包括体内肝神经递质的失活、生理性解毒、组织学和超微结构变化相关的分子机制等方面的问题需要解决。水华束丝藻毒素从滇池水华束丝藻藻株中提取，毒素含量经高效液相色谱分析表明：该毒素的主要成分为漆沟藻毒素1、5(GTX1, GTX5)和新哈贝毒素 (neoSTX)，所占比分别为34.04%、21.28 %和12.77%。斑马鱼通过腹腔注射毒素对其进行毒素处理，低剂量组为5.3g STX eq/kg，高剂量组为7.61g STX eq/kg。在毒素处理后1-24h内的不同时间点研究斑马鱼肝脏的生理生化、组织学和超微结构变化、以及肝乙酰胆碱酯酶（AChE）和单胺氧化酶（MAO）活性在神经递质传导功能中的变化。研究结果表明，毒素处理的3-12h期间，斑马鱼肝丙氨酸氨基转移酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）活性增强，组织学和超微结构损伤加重。毒素暴露增加了肝脏的活性氧和抑制总抗氧化能力，进一步表明发生氧化胁迫。毒素也明显抑制肝脏AChE 和MAO活性，意味着斑马鱼肝脏的神经递质灭活/传导功能出现异常。且所有的变化呈现计量-时间效应关系。

结论，束丝藻毒素或PSPs通过抑制肝脏的AchE和MAO活性诱导氧化应激，导致斑马鱼肝的神经毒性。以上参数可作为研究蓝藻水华束丝藻及其分泌的束丝藻毒素 / PSPs的生物指标。

关键词

蓝藻毒素、斑马鱼肝脏、形态学改变、乙酰胆碱脂酶、单胺氧化酶、神经毒素

1.引言

产毒水华蓝藻优势种属水华束丝藻，分泌蓝藻神经毒素或麻痹性贝类毒素。水华束丝藻在全世界均有暴发，是一个全球性问题。这些水华及其分泌的有害次级代谢产物（毒素）对水生态系统造成不良影响。近年来，我国云南滇池就暴发过以滇池水华束丝藻藻株为优势种的水华，而滇池肩负着为云南昆明市及其周边地区附近农业、饮用水、娱乐、旅游业提供新鲜水源的重任。水华和它们产生的毒素给滇池周边环境安全和生活在周边地区的人民的健康带来了严重危害。PSPs是一种很强的神经毒素，主要分布在海洋中，由甲藻分泌，但也分布在淡水中，由淡水蓝藻和细菌分泌。PSPs可在水生动物体内高水平的积累而不对这种动物产生中毒影响，但当人类或其他动物食用这些受毒素污染的水生动物时则会导致中毒。此外，束丝藻毒素/PSPs耐热、耐酸碱，难以通过普通方法如烹饪而完全去除其毒性 。

鱼一般认为是水体中食物链的顶端重要的生物，因此可以作为水生生态系统整体健康情况的研究指标。斑马鱼是淡水生态系统重要的模式生物。它非常适合用来检测环境污染物及其毒性的研究，故而人们对斑马鱼关注越来越多。斑马鱼合成最典型的脊椎动物的神经递质，并且它的神经内分泌系统有着旺盛的生理应激反应。它还具有体积小、成本低、易繁殖，繁殖周期短、产蛋量高、可体外受精和发育，胚胎透明和遗传背景良好的优势。以往的研究表明，PSPs可通过鱼类食用被污染的食物而进入鱼体内。进而在肌肉内积累而影响鱼类发育，导致幼年和成年鱼的游泳能力受损、畸形甚至死亡。

肝是毒素解毒和代谢的重要器官。组织学和/或超微结构的变化，丙氨酸氨基转移酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、活性氧（ROS）、总抗氧化能力（T-AOC）变化等生理、生化、应激反应指标可用于评估鱼体内人为或自然的污染情况。单胺氧化酶 (MAO)和乙酰胆碱酯酶 (AChE)是单胺神经递质，如去甲肾上腺素/肾上腺素和来自交感神经的其他单胺神经递质，以及来自迷走神经的胆碱能神经递质在动物肝脏中分解的关键酶。已有研究表明莠去津、农药和微囊藻毒素处理后动物的这些指标的变化。但蓝藻神经毒素或PSPs处理后鱼类这些指标的变化研究却很少。

本实验通过检测斑马鱼亚致死剂量的滇池束丝藻藻株分泌的束丝藻毒素/PSPs处理后斑马鱼肝组织学和超微结构、ALT、AST、ROS、T-AOC、AChE和MAO变化，以探讨该毒素的肝脏神经毒性。这些结果将有助于我们进一步了解鱼类代谢和解毒蓝藻毒素/PSPs过程中肝脏的作用。

2.材料与方法

2.1 药品

PSPs的标准品为STX(dcSTX, STX, neoSTX)和膝沟藻毒素(GTX1素)neoSTX)oSTX)，均由加拿大NS哈利法克斯国家研究理事会提供。其他药品若无特别说明，均为优等级试剂，从其它试剂公司购买。

2.2毒素准备

滇池水华束丝藻藻株来自滇池水华，并经无菌BG11培养基纯化，-20℃储存待分析。0.01M醋酸萃取两次，经沉淀、过滤、旋转蒸发器中浓缩至干燥，Sep-Pak C18 萃取纯化。所得即为束丝藻毒素。

束丝藻毒素经带荧光系统的LC20A高效液相色谱(HPLC)系统分析。用岛津 Class-CR10软件进行数据处理。

从滇池水华束丝藻藻株中提取的STXs和GTXs通过和标准色谱图比较确定。毒素的浓度由因子响应（峰面积/毒素浓度）决定。提取样品的总体毒性在毒素总量和相对于STX的相对毒性的基础上以STX当量计算。纯化的毒素-20℃下保存。

2.3 毒素处理剂量的选择

共有约300条鱼用来确定毒素剂量。毒素剂量方法参考以前的研究确定，并略作改进。现简述如下：一条鱼用50作改一次性无菌微量注射器腹腔注射起始剂量的粗提毒素（5次性，含量为9.28STX g/kg，6.4g STX eq/kg的毒素，用0.01M乙酸稀释至30稀释）。如果鱼在24h内死亡，接下来的鱼则降低注射剂量（0.01M乙酸稀释），否则提高注射剂量，直至鱼刚好存活24h，在此剂量基础上，接下来的鱼提高注射剂量。重复此过程，直至确定0-100%的致死剂量。这一系列实验确定低、高剂量分别为5.3和7.61g STX eq/kg体重。低剂量组发生明显的中毒行为，但没有死亡；高剂量组发生严重的中毒行为，并伴有低死亡率（30%）。对照组注射0.01M的乙酸溶液。

2.4 肝脏的准备

本实验共用150只健康雄性斑马鱼（每个终点）（中国国家重点实验室斑马鱼中心提供）。所有的鱼受精、培养处理和培养条件尽量保持一致，斑马鱼在实验室驯化10天后，随机分为对照、低、高剂量组。低剂量组和高剂量组分别腹腔注射30分为对含有5.3和7.61g STX eq/kg束丝藻毒素的0.01M乙酸溶液。对照组腹腔注射30溶液。对照组腹腔的乙酸溶液。毒素处理后的1、3、6、9、12、24h，每组取5条鱼-8℃冰冻低温麻醉。剖腹速取肝脏，一批样品经液氮速冻后冻藏与-40℃冰箱进行生理学分析。另一批样品在10%中性甲醇固定液固定24h以上进行组织学分析，第三批样品经2.5% w/v戊二醛固定后2h以上进行超微结构分析。肝组织蛋白质浓度采用考马斯亮蓝G250法测定。所有试验进行了3个重复。

2.5 肝脏组织学分析

斑马鱼肝脏经10%中性甲醇固定液固定24h后，流水冲洗，系列梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。切片（6石蜡）用苏木精-伊红染色，尼康显微镜下观察，摄像进行组织结构异常研究。

2.6 肝超微结构异常检查

每组每个时间点的鱼的肝脏，用2.5% w/v的戊二醛预固定2h以上，0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）洗3次，1% w/v水四氧化锇-4℃后固定2h。固定好的肝组织用配置有Epon 812和连续超薄切片的超薄切片机切片。切片用醋酸铀和柠檬酸铅染色，透射电镜下观察。

2.7 生化指标分析

ALT、AST、 ROS、 T-AOC、 MAO和AChE用试剂盒检测，方法严格根据试剂盒说明书操作。在96孔检测板中检测反应物的光密度值(OD值)。ALT、AST活性单位用每毫克蛋白质的酶活力单位表示。一个ROS活性单位用每毫克蛋白质每分钟降解1微摩尔H₂O₂表示。一个T-AOC活性单位定义为37℃条件下，每毫克蛋白质每分钟使反应液OD值增加0.01。AChE活性单位定义为每毫克蛋白质每6分钟水解1微摩尔底物。MAO的活力单位定义为37℃条件下，反应液OD值增加0.01。所有实验进行了3个重复。

2.8 数据处理

数据用数据软件(SPSS 16.0,Chicago, IL, USA)分析。ALT、AST、 ROS、 T-AOC、AChE和MAO结果用3组平行的均值表示。采用单因素方差分析(ANOVA)与最小显着差异事后检验的统计意义的差异进行了评估。Plt;0.05，差异显著，plt;0.01，差异极显著。

3. 结果

3.1毒素分析

HPLC分析表明，从滇池水华束丝藻藻株中提取的束丝藻毒素根据与毒素标准品比较确定其包含3种有毒成分：neoSTX，GTX1和GTX5。其总PSP毒素含量为9.52ng/mg干重。GTX1、GTX5和neoSTX分别对STX的相对毒性相加得样品的总体毒性为6.51 ng STX eq / mg干重。高效液相色谱-荧光检测证实提取的毒素纯度为69.57%。GTX1是主要的毒素，占总PSP的34.04%；其次是GTX5，占21.28%；最后是neoSTX，占12.77%。然而PSP的C毒素标准品（n-sulfocarbamoyl-11-hydroxysulphate）难以获得，故未对其进行分析。还需进一步的研究来分析在同一样品中存在的其它成分。

3.2.ALT活性变化

束丝藻毒素处理组较对照组明显增加(p lt; 0.05)。毒素处理3-12h，高、低剂量组的平均ALT活性分别比对照组高3.15和1.67倍。肝脏中ALT水平在毒素处理1h后开始升高，3-12小时后逐步升高，12h时达到最大值，高、低剂量组相比对照组分别平均升高2.49、1.81倍，24h后逐步恢复。（图1）

图1：束丝藻毒素处理后斑马鱼肝脏ALT活性。所有数据以均值plusmn;标准差表示。C、L、H分别表示对照组、低剂量组、高剂量组。*p lt; 0.05, **p lt; 0.01, ***p lt; 0.001都是与对照组比较得出的。

3.3.AST活性变化

斑马鱼肝脏AST活性束丝藻毒素处理组较对照组明显增加(p lt; 0.05)。毒素处理3-12h，高、低剂量组的AST活性分别比对照组平均高1.49和1.69倍。肝脏中ALT水平在毒素处理1h后开始升高，3-12小时后逐步升高，12h时达到最大值，高、低剂量组相比对照组分别平均升高1.55、1.78倍，24h后逐步恢复。（图2）

图2：束丝藻毒素处理后斑马鱼肝脏AST活性。所有数据以均值plusmn;标准差表示。C、L、H分别表示对照组、低剂量组、高剂量组。*p lt; 0.05, **p lt; 0.01, ***p lt; 0.001都是与对照组比较得出的。

3.4.肝脏组织变化

斑马鱼肝脏在毒素处理后发生了组织学改变。两毒素处理组在初始阶段（1-3h）表现出相似的组织学变化，毒素处理1h后充血，3h后水肿。毒素处理6-12h，高剂量组水肿加重，并伴随有空泡化、肝细胞坏死，而低剂量组发生渐进的核固缩和凋亡。毒素处理24后，高低剂量组均部分恢复正常。（图3、4）

图3：低剂量毒素处理后斑马鱼肝脏组织变化。A：对照；B：毒素处理1h肝窦初始充血（△）；C-F：毒素处理3-12h肝窦充血及渐进性肝细胞凋亡。图中横线长度 = 25 进性。

图4：高剂量毒素处理后斑马鱼肝脏组织变化。A：对照；B-D：毒素处理6-9h中心静脉（☆）肝细胞质空泡化和周围组织损坏（*）。图中横线长度 = 25 长度。

3.5.肝脏超微结构变化

透射电镜显示，束丝藻毒素处理组肝细胞超微结构和肝细胞异常。毒素处理组细胞间隙扩大，细胞质和细胞器肿胀、空泡化，细胞骨架和细胞器损坏，糖原、脂质聚集，核畸变，形成细胞凋亡体。毒素处理1h，试验组肝细胞光传输增强，表现出明显水肿，毒素处理3h，试验组出现水肿细胞器，包括线粒体、内质网和核膜，其特征是细胞内出现空泡。毒素处理6h，细胞器和细胞水肿进一步加重，部分空泡扩大，导致细胞核变形，空泡形成。但是高、低剂量组的细胞和细胞器结构变化不同。毒素处理9-12h，高剂量组发生液泡破裂或融合，细胞器损坏，光传输增加表明出现坏死性变化；低剂量组细胞凋亡体增多。这些结果表明，低浓度的束丝藻毒素主要是引起细胞凋亡，高浓度则引起细胞坏死。（图5）

图5：束丝藻毒素处理后斑马鱼肝脏超微结果异常。A：对照；B：毒素处理1h，初始胞质水肿（*）和脂质积累（☆）；C：毒素处理3h，细胞器和细胞质囊泡水肿（uarr;），脂质积累（☆）；D：毒素处理6h，脂质积累加重（☆），脂质空泡形成（）和核融合变形（）。E和F：毒素处理9-12h，高剂量组严重空泡融合（）；G：毒素处理12h，低剂量组细胞凋亡体形成（）；H：毒素处理3h，细胞间隙扩大（▲）。图例：A、C、D、E=2例：，B、F、G、H=1例：。

3.6.ROS含量变化

束丝藻毒素处理后，斑马鱼肝脏ROS含量明显发生了变化（plt;0.05）。毒素处理1-12h，高低剂量组平均ROS含量分别比对照组高3.15和2.55倍。但是，毒素处理12-24h，ROS含量无明显变化。毒素处理1h，肝脏ROS含量增加，3-12h增加更加明显。毒素处理12、9h，ROS含量达到最大值，高低剂量组相比对照组分别平均增加3.78和2.89倍。毒素处理24h，肝脏ROS含量逐渐恢复。（图6）

图6：束丝藻毒素处理后斑马鱼肝脏的ROS。所有数据以均值plusmn;标准差表示。C、L、H分别表示

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