体外制备阿尔茨海默病双股螺旋细丝并纯化重组Tau蛋白外文翻译资料

 2022-09-15 14:54:02

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体外制备阿尔茨海默病双股螺旋细丝并纯化重组Tau蛋白

总结：Tau蛋白是神经微管相关蛋白。在阿尔茨海默病病人脑中发现，Tau蛋白作为不溶性纤维，除生理学功能外，还具有结合及稳定微管的功能，基于这点，Tau蛋白被称为“双股螺旋细丝”。探究Tau蛋白聚合的基本原理对于辨别不可抑止的聚合情况与预防双股螺旋细丝形成是必可不少的，因为这将减缓甚至终止阿尔茨海默病病人神经元的退化变性。本章，将介绍用于研究Tau蛋白聚合成双股螺旋细丝过程的必要方法，具体来说包括：纯化重组表达Tau蛋白的实验方案；聚阴离子介导的Tau蛋白聚合成双股螺旋细丝的通用方法；双股螺旋细丝的基于荧光的定量实验；双股螺旋细丝穿透式电子显微镜的负染成像及鉴定。

关键词：阿尔茨海默病；Tau蛋白；双股螺旋细丝；纯化；聚阴离子介导的聚合作用；硫磺素试验; 电子显微镜；淀粉纤维

  1. 介绍

阿尔茨海默病有两种典型的病理性蛋白沉淀。一种是阿尔茨海默病淀粉纤维，该淀粉纤维含有beta;淀粉多肽，此多肽导致淀粉纤维斑；另一种是Tau蛋白纤维（即双股螺旋细丝，）该纤维可导致神经元纤维缠结。beta;淀粉多肽具有局部疏水特性，相反Tau蛋白由于具有亲水特性而高度可溶。对于这两种情况，建立一套关于纤维的通则仍有待讨论。Tau主要发生在神经元的轴突隔间。在人类中心神经系统中，共有6种Tau蛋白异构体存在，这源于17号染色体上一个单基因的可选择性剪接。Tau蛋白的功能在于结合并稳定微管，而微管是作为动力蛋白在轴突运输时的运动路径。其氮末端一般投射在外远离微管表面，相反碳末端则一半与微管结合。碳末端结构域含有约31个残基，其中含3-4个伪重复残基，这几个伪重复残基对于微管的结合和Tau蛋白病理性聚集成双股螺旋细丝是至关重要的。

单体Tau蛋白在溶液中的二级结构尤其是双股螺旋细丝中Tau蛋白的二级结构一直以来都是争议的焦点。总的来说，单体Tau蛋白呈现出圆二光谱的特性，这一特性与疏水性氨基酸化合物一致。圆二光谱的特性是由一任意的圆形范式所反映的。从Tau蛋白的序列可以发现，部分多肽会形成ɑ螺旋，但是这一现象局限于非生理缓冲区域，包括介导螺旋的试剂。关于使用神经元纤维缠结的X射线纤维图研究双股螺旋细丝中Tau蛋白和再组装Tau蛋白纤维的早期研究表明beta;结构的影响甚是微弱或可视为无影响。诚然，神经元纤维缠结和Tau蛋白纤维很难被刚果红染色。与硫磺素相比，刚果红被认为是一种可以指示交叉beta;结构的染色剂。近期研究表明，基于Tau蛋白聚合成双股螺旋细丝，结构层面发生了从随机的圈形结构向beta;结构的转变。

模拟阿尔茨海默病中双股螺旋细丝的形成，在体外制备双股螺旋细丝进程受到阻碍，面临聚合速率低和产量低的难题。该问题有几种解决方法：（a）增加某种特定聚阴离子的辅助因子的量，该辅助因子可增加反应速率，诸如聚阴离子（肝素，多聚谷氨酸和核糖核苷酸）和脂肪酸（花生四烯酸）；（b）限制Tau蛋白的某特定域，比如只有重复域时的Tau蛋白比全长Tau蛋白更容易聚合成真正的双股螺旋细丝；（c）引入在额颞叶痴呆中发生的突变，比如△K280和P301L，这将加速或者增加双股螺旋细丝的聚合。总的来说，Tau蛋白的病理性聚合可以描述为成核延伸反应，该反应与重复域中某些六肽基序周围beta;结构的形成有关。Tau蛋白重复域已足够形成双股螺旋细丝并且形成Tau蛋白纤维的核心，该Tau蛋白纤维重组于重组Tau蛋白，它与阿尔茨海默病病人脑中的纤维具有相似性。如今的聚合实验选择在氧化或者还原条件下利用聚阴离子或者脂肪酸进行。本章，旨在描述纯化表达的重组Tau蛋白与根据Tau蛋白的亚型制备双股螺旋细丝的常规方法。我们将重点强调从Tau蛋白的重复概念看还原和氧化条件与双股螺旋细丝形成的影响。

在溶液中和实时测定双股螺旋细丝聚合产物的方法如今是可以找到的。具体来说，方法有增加报告染色剂的荧光（硫磺素）或者光散射。本章，我们将重点关注硫磺素方法记录双股螺旋细丝的聚合过程。

如何评价实际的组装情况取决于电子显微镜是否能显示出纤维呈双股螺旋状态。因为呈现出双股螺旋状态是阿尔茨海默病双股螺旋细丝的特点，具体来说，它在80纳米处有特殊的交叉重复现象，并且宽度处于10纳米至20纳米之间。直线型细丝也会有所形成，但是在这种情况下，与其他类型的区别和聚合通路则清除的更少。本章最后描述的方法是采用电子显微镜采集双股螺旋细丝的整体成像并鉴别。总体说来，本文描述的是纯化重组Tau蛋白的主要原则、体外制备和鉴定类阿尔茨海默病双股螺旋细丝的方法。

  1. 材料

2.1蛋白质表达和纯化

1.通用高效液相色谱设备：比如，高效液相色谱设备，试样环管（50-150毫升），取样器等。

2.凝胶渗透色谱柱（比如：HiLoad16/60复合凝胶TM200用于Tau蛋白亚型，复合凝胶TM75用于短Tau蛋白结构；阿莫仙生物科学，弗赖堡，德国）。

3.阳离子交换色谱柱（比如：自密封XK16柱，带有约20mL阳离子交换层析柱快速流通色谱材料；阿莫仙生物科学）

4.透析管（去除分子质量为3.5KDa的蛋白质分子）

5.法式滤压壶

6.聚丙烯酰胺凝胶电泳设备

7.细菌细胞颗粒重悬缓冲液：20mM 脂肪酸甲酯磺酸盐，1mM 乙二醇双四乙酸，0.2mM氯化镁，5mM 二硫苏糖醇，1mM 苯甲基磺酰氟，10ug/mL 亮肽素，2mM苄眯，10ug/mL 抑胃肽胃蛋白酶抑制剂 A，PH为6.8。加入二硫苏糖醇、苯甲基磺酰氟、亮肽素、苄眯、抑胃肽胃蛋白酶抑制剂 A，这些物质优先使用。

8.阳离子交换色谱缓冲液A：20mM 脂肪酸甲酯磺酸盐，50mM氯化钠，1mM 乙二醇双四乙酸，1mM氯化镁，2mM 二硫苏糖醇（新加入），0.1mM 苯甲基磺酰氟（新加入），调至pH值为6.8。

9. 阳离子交换色谱缓冲液B：20mM 脂肪酸甲酯磺酸盐，1M氯化钠，1mM 乙二醇双四乙酸，1mM氯化镁，2mM 二硫苏糖醇（新加入），0.1mM 苯甲基磺酰氟（新加入），调至pH值为6.8。

10.凝胶过滤缓冲液：磷酸盐缓冲液（137mM氯化钠，3mM氯化钾，10mM磷酸一氢钠，2mM磷酸二氢钾，调pH值为7.4）加入1mM二硫苏糖醇（新加入）调至pH值为7.4。

2.2制备和鉴定双股螺旋细丝

1.肝素（分子质量约为6000道尔顿，西格玛，奥尔德里奇）

2.蛋白酶抑制剂：苯甲基磺酰氟，乙二胺四乙酸，乙二醇双四乙酸，亮肽素，抑肽酶，抑胃肽胃蛋白酶抑制剂A

3.硫磺素（西格玛，奥尔德里奇）

4.硫磺素试验并行处理：微量盘荧光分光计（比如，荧光分析仪 荧光分光计，酶标仪，赫尔辛基，芬兰）和黑色微孔板（比如，386孔板，临检用酶标板，酶标仪）

5.穿透式电子显微镜负染设备（穿透式电子显微镜，穿透式电子显微镜样品网格[比如，600网格的碳覆盖铜网格]，尖镊子[杜蒙，五号，醋酸双氧铀]）

  1. 实验方法

这一小节将涉及以下几点：1）从大肠杆菌体内表达的重组蛋白中纯化Tau蛋白。2）从Tau蛋白中制备真实的双股螺旋细丝的常用方法。3）概述用于从Tau蛋白中鉴定和监测双股螺旋细丝形成动力学的方法。

3.1Tau蛋白的纯化

在大肠杆菌BL21株系中，Tau蛋白可大量重组表达。使用的载体是pNG2载体，该载体是pET-3载体的衍生载体。10升培养基中可以获得10-100毫克的蛋白质，获得的蛋白质的质量的多少取决于Tau蛋白的亚型种类或者是Tau蛋白的构造。预估纯化率可达95%以上。虽然在艾伦美式烧瓶中进行常规表达也可以获得好的结果，但是若是使用10升甚至更多培养基用于表达，则可选用生物发酵罐。

1.通过离心收获细菌细胞，细胞体重悬于冰冷的细菌细胞体重悬缓冲液中。取一试样并使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

2.重悬细胞可选择于进行高效液相色谱前至少直接抽提至渗析（第六步）阶段或是于-20℃冻存用于后续处理。

3.用法式细胞破碎机裂解细胞两次（假定一直处于冰冷的条件下——因为在裂解后的细胞中蛋白质将快速降解）。取一试样并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析Tau蛋白。

4.添加氯化钠至氯化钠终浓度为500mM，并煮沸20分钟。该处理可使除Tau蛋白之外的几乎所有蛋白质变性，而Tau蛋白仍可留于溶液中并保持其生理功能。

5.在4℃127000g条件下离心40分钟，变性的蛋白质与细胞碎片将聚集成颗粒。从上清液与沉淀中分别取一试样，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析Tau蛋白。

6.将上清液倒入透析管（去除分子质量为3.5KDa的蛋白质分子）内，并在4℃不断搅拌的条件下过夜透析（第一次换缓冲液应在渗析2小时之后）。渗析过程中换两次阳离子交换色谱缓冲液A。

7.在4℃，127000g条件下离心40分钟去除透析液。取一试样并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析Tau蛋白质。

8.将洗后的上清液加入阳离子交换色谱柱内。

9.用3-5管体积的阳离子交换色谱缓冲液A冲洗出非特异性蛋白质，至获得稳定的紫外吸收值。

10.用超过6管的线性梯度的60%终浓度的阳离子交换色谱缓冲液B洗脱Tau蛋白并分馏。从含有蛋白质的洗脱液组分中取一试样，以紫外吸收作为测试标准，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析Tau蛋白。

11.将含有Tau蛋白的样品混合起来，并用超过滤装置（比如，呋吗唑酮，密理博公司；Tau蛋白亚型的截留分子量为10KDa，短Tau蛋白重复结构的截留分子量为5KDa）浓缩至终体积为0.5-1mL，其中含有5-10mg的Tau蛋白（用考马斯亮蓝试验确定含量）。取一试样并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析Tau蛋白。

12.将Tau蛋白浓缩后加入凝胶过滤柱内，控制凝胶过滤缓冲液在一低流速（比如0.5mL/min）流出。当蛋白质洗脱完后，未更快完成获得结果，可增加流速。从含有蛋白质的洗脱液组分中取一试样，以紫外吸收作为测试标准，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析Tau蛋白。

13.将含有一定量降解的Tau蛋白和Tau蛋白二聚体的达到预计纯度的Tau蛋白组分混合。确定蛋白质浓度并在-80℃条件下储存aliquoted。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测混合样品中取一试样以确定终纯度并为后续实验提供参考。

3.2Tau蛋白中双股螺旋细丝的制备

在3.2.1小节中，我们将在还原性条件下，以最长的Tau蛋白亚型Tau蛋白40（具有4个重复的一种亚型）和最短的Tau蛋白亚型Tau蛋白23（具有3个重复的一种亚型）为例，描述制备双股螺旋细丝的过程。在第二部分，我们将关注在还原或是氧化情况下3个和4个Tau蛋白重复域结构的双股螺旋细丝的制备。这取决于是否用到Tau蛋白亚型或是Tau蛋白重复域结构。体外制备真实的双股螺旋细丝所需的时间从两周到几小时不等。无论是何种情况，双股螺旋细丝的聚合皆是由辅助因子肝素介导，该辅助因子和显著提升比率和Tau蛋白聚合的速度。

3.2.1Tau蛋白亚型中双股螺旋细丝的制备

1.优先双股螺旋细丝聚合体的动力学分析。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测使用的Tau蛋白的浓度、纯度、降解程度和可能的二聚体形成（寡聚合作用）。这显著影响了Tau蛋白聚合成双股螺旋细丝的效率。

2.Tau蛋白聚合反应条件为：50uM亚型Tau蛋白，12.5uM肝素和1mM苯甲基磺酰氟，其为蛋白酶抑制剂混合物，1mM乙二胺四乙酸，1mM乙二醇双四乙酸，1ug/mL亮肽素，1ug/mL抑胃肽胃蛋白酶抑制剂。磷酸盐缓冲液含2mM二硫苏糖醇，其pH值为7.4。

3.在37℃条件下孵化。

4.选择适当次数，使用硫磺素荧光和穿透式电子显微镜检测双股螺旋细丝的组装情况。约需2周时间获得Tau蛋白双股螺旋细丝组装的最终值。

5.如果4重复Tau蛋白发生聚合，则保持每天加入1mM二硫苏糖醇。

3.2.2Tau蛋白重复域构造中双股螺旋细丝的制备

1.优先双股螺旋细丝聚合体的动力学分析。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测使用的Tau蛋白的浓度、纯度、降解程度和可能的二聚体程度（寡聚合作用）。这显著影响了Tau蛋白聚合成双股螺旋细丝的效率。

2.Tau蛋白重复域聚合反应条件为：20uM Tau蛋白，5uM肝素溶于pH值为7.4含有或者不含1mM二硫苏糖醇的磷酸盐缓冲液中。

3.在37℃下孵化。

4.固定使用硫磺素荧光和穿透式电子显微镜检测双股螺旋细丝的组装情况。约需3天时间获得Tau蛋白双股螺旋细丝组装的最终值。

3.3验证双股螺旋细丝的聚合

首先，我们将描述一种用于定量聚合成双股螺旋细丝的Tau蛋白的方法，该方法基于Tau蛋白双股螺旋细丝聚合的动力学研究。第二部分则是描述可以证明双股螺旋细丝形成的结果，该结果是在穿透式电子显微镜下运用负染成像所得。

3.3.1采用硫磺素荧光试验定量双股螺旋细丝

证明Tau蛋白聚合成双股螺旋细丝可采用硫磺素荧光试验。染色剂结合至双股螺旋细丝，这可导致荧光发射光谱的移动。使用荧光分光计，可检测发射荧光的强度，这提供了一种定量检测双股螺旋细丝的方法。单体Tau蛋白，二聚体Tau蛋白，未成结构的高聚合体形式的Tau蛋白均无法造成荧光移动。因此，硫磺素可以用于验证Tau蛋白双股螺旋细丝的聚合作用甚至可用于定量研究聚合动力学。

1.在黑386微孔板中制备总体积为50ul的试验溶液，该微孔板含10uM的硫磺素，5-15uMTau蛋白，该Tau蛋白来源于双股螺旋细丝聚合反应的样品中，本样品溶于磷酸缓冲液中，其pH值为7.4。

2.为了作为背景荧光，光散射和单体Tau蛋白或肝素与硫磺素的荧光反应的对照，需向硫磺素试验样品中添加足量的溶液以配制下列对照组：（a）只添加缓冲液，（b）只添加Tau蛋白，（c）只添加肝素（最好与Tau蛋白

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