microRNA-29家族在急性骨髓性白血病中的作用、机制和潜在的治疗应用外文翻译资料

 2022-11-15 14:57:36

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microRNA-29家族在急性骨髓性白血病中的作用、机制和潜在的治疗应用

造血干细胞/祖细胞的异常增殖，凋亡抑制和分化阻滞已被认定为导致急性骨髓性白血病（AML）的主要原因。往年的研究表明，miR-29a和miR-29b可作为白血病发生中的肿瘤抑制因子。 然而，关于miR-29家族的功能和机制，在AML中的发展前景及其在AML治疗中的潜力所做的综合调查仍有待阐明。在这里，从我们的报告中发现，与健康供体相比，来自AML患者的外周血单核细胞和骨髓（BM）CD34 细胞的家族成员miR-29a，-29b和-29c发生了共同下调。THP1和NB4细胞中每个miR-29成员的过度表达都会抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。 AKT2和CCND2 mRNA被证明是miR-29成员的靶标，miR-29家族的作用归因于Akt2和CCND2（两个关键信号分子）的减少。检测到AML病例中Akt2，CCND2和c- M y c水平明显有着升高，是与AML细胞中miR-29表达降低相关。 此外，在骨髓白血病发生中发现包含c-Myc，miR-29家族和Akt2的反馈回路。 每个重新引入的miR-29成员都能修正部分异常的细胞增殖、凋亡抑制以及在AML BM爆发时发生的骨髓分化停滞。 在AML模型小鼠中静脉注射miR-29a，-29b和-29c可显明缓解白血病症状。 总之，我们的发现揭示了miR-29家族在AML发展中的关键作用，以及可以为在AML患者中拯救miR-29家族的表达提供新的治疗策略。

急性骨髓性白血病（AML）是一种恶性造血肿瘤，其特征在于骨髓（BM）造血干/祖细胞（HSPC）群体中会发生骨髓分化停滞、快速生长和凋亡抑制。 法国 - 美国 - 英国（FAB）分类系统将AML分为8个亚型，从M0到M7，涉及单核细胞和粒细胞谱系（M1-M5亚型）的AML病例占成人患者的90％。

在过去三十年中，AML治疗取得了很大进展，涉及新药和异基因干细胞移植。 然而，总体生存并不乐观，特别是对于老年患者。 最近关于AML发病机制的研究表明，遗传性疾病在确定对化疗和结果的反应中有着最重要的作用，这造成了靶向治疗将被纳入标准治疗，并在AML治疗中开辟新的激动人心的时代。 新兴药剂包括吉妥单抗CD33，组蛋白脱乙酰酶和蛋白酶体抑制剂，抗血管生成剂，Fms样酪氨酸激酶3抑制剂等。

微小RNA（miRNA）是在转录后水平上负调节基因表达的小的非编码RNA，其是在正常和恶性生物过程中具有重要作用的调节因子。因此，这些失调的miRNAs及其反应性靶标的鉴定可为癌症诊断和癌症治疗中的治疗靶点提供潜在的生物标志物。

MiR-29家族是研究最多的miRNA之一。 它包含三个成员，miR-29a，-29b和-29c。 成熟miR-29成员的序列高度同源并含有相同的“种子序列”。MiR-29s主要作用于地套细胞淋巴瘤，肝细胞癌，白血病，肺癌等肿瘤抑制因子。

然而，miR-29成员也可以促进细胞迁移和侵入，并抑制乳腺癌细胞和肝癌细胞的细胞凋亡。 据报道，在AML中，miR-29a和miR-29b而不是miR-29c在单体7的AML患者中被下调，我们以前的工作表明，忽略AML亚型的AML患者的miR-29a明显下调。尽管成熟的miR-29a / b / c序列具有很高的相似性，但一些研究表明miR-29家族的不同同工型可以执行不同的功能。因此，对AML治疗中miR-29s功能，机制及其潜力仍然需要进行综合研究。

在这里，我们证明miR-29家族成员在AML患者中一致地下调，并通过靶向AKT2和CCND2 mRNA调节细胞增殖和凋亡而发挥肿瘤抑制作用。miR-29s异位移植到AML模型小鼠中明显缓解了白血病症状。 我们的研究结果加强了对AML发展中miR-29家族功能和机制的了解，并进一步证明了其在AML治疗中的潜力。

结果

所有miR-29家族成员的表达在AML患者中显着下调。我们在81例新诊断的AML患者（M1-M5亚型）和93例正常对照的外周血单核细胞（PBMNCs）中首次进行了Taqman干环RT-PCR，以分析miR-29s的表达模式。 确定了用于检测miR-29a，-29b和-29c的Taqman探针和引物的特异性（补充图S1）。 我们观察到与健康供体相比，在AML样品中检测到miR-29a，-29b和-29c明显呈现着降低的表达变化趋势（图1a）。 在不同的AML亚型组和不同染色体和分子异常的患者中检测不到miRNA表达存在着差异。受体操作特征（ROC）曲线分析表明，所有三种miRNA的表达水平可作为AML诊断具有高敏感性和特异性的标志物（图1b）。

MiR-29s参与调节细胞增殖和细胞凋亡。由于分化阻滞，异常细胞增殖和凋亡抑制是导致致癌作用的关键原因，miR29a在骨髓分化中的重要作用已被证明，我们想检查每个miR-29成员是否会影响骨髓中的细胞增殖和凋亡。我们将miR-29a，-29b，-29c和对照模拟物转染到THP1和NB4细胞中，并在转染后72h测量了0、24、48、72小时和96小时的活细胞百分数和凋亡细胞。 结果表明，任何miR-29家族成员的过度存在能够在很大程度上抑制细胞增殖（图2a），并诱导THP1和NB4细胞的早期和晚期凋亡（图2b和c）。

AKT2和CCND2是miR-29家族成员的常见靶标。使用三种在线软件：TargetScan，miRanda和PicTar，我们确定了miR-29家族的几个潜在靶点（数据未显示）。 在这些基因中，我们选择AKT2和CCND2进行进一步研究，因为它们在促进癌症发展中起关键作用。 它们的30UTR（非翻译区域）中有两个假定的结合位点（图2d）。 为了检测miR-29成员能否直接调节AKT2和CCND2，我们首先进行双重荧光素酶报道实验，发现转染miR-29a，-29b或-29c模拟物后，AKT2_WT和CCND2_WT的荧光素酶活性36小时内明显会降低。然而，单突变和双重突变部分或完全消除了每个miR-29成员的抑制，表明miR-29家族可以特异性地靶向AKT2和CCND2的30UTR中的结合位点（图2e）。在用miR-29a，-29b或-29c模拟转染后，两种蛋白质（图2f，左）和mRNA水平（补充图S2）两种骨髓白血病细胞系THP1和NB4中的内源性AKT2和CCND2的表达明显在48小时内降低。此外，当通过miRNA抑制剂降低内源性miR-29a，-29b和-29c表达时，检测到两个靶标的蛋白质水平升高（图2f，右图）。上述结果表明，AKT2和CCND2作为THP1和NB4细胞中miR-29的常见靶基因。

MiR-29s通过靶向AKT2和CCND2 mRNA调节细胞增殖和凋亡。为了检测miR-29s的细胞增殖和细胞凋亡的调节是否直接通过Akt2和CCND2介导，我们首先转染了特异性干扰THP1和NB4细胞中AKT2或CCND2表达的siRNA，并确认AKT2或CCND2的降低可以减少细胞增殖并促进细胞凋亡（补充图S3）。

然后我们通过转染3-UTR-阴性AKT2和CCDN2以及miR-29进行救援实验。就如预期的那样，用pcDNA3.1_AKT2（或pcDNA3.1_CCND2）转染可以减轻由miR-29b模拟物处理产生的Akt2和CCND2蛋白水平的降低（图3a）。与靶蛋白的表达一致，用pcDNA3.1_AKT2（或pcDNA3.1_CCND2）转染减轻了细胞扩增的抑制（图3b）和miR-29模拟物治疗引起的凋亡细胞增加（图3c）。

我们还通过在THP1细胞中用AKT2 siRNA（或CCND2 siRNA）和miR-29a抑制剂（或miR-29c抑制剂）的组合进行转染来进行抢救实验。 结果表明，用AKT2 siRNA（或CCND2 siRNA）转染可减轻miR-29抑制剂治疗引起的细胞增殖和凋亡细胞减少（附图4）。

上述数据表明miR-29对细胞增殖和凋亡的影响归因于其靶蛋白Akt2和CCND2。

miR-29家族对细胞增殖和凋亡的调节依赖于Akt通路和p-Rb水平。由于Akt2是作为PI3K / Akt信号通路中枢的Akt家族的三个成员之一，我们测量了转染后的NB4和THP-1细胞中下游p-Akt（Ser473）和p-GSK3b的水平 ，在对-29a，-29b，-29c或对照模拟操作48h后，发现每个miR-29家族成员的过表达降低了Akt和GSK3b的磷酸化水平（图3d），这与观察到NB4和THP- 1细胞与特异性检测AKT2的siRNA降低p-Akt和p-GSK3b水平有关。（图3e）

CCND2是细胞周期蛋白的一个成员，参与促进细胞周期从G1期转向S期，并通过调节Rb的磷酸化功能。因此，我们测量NB4和THP1细胞中的p-Rb和总Rb，并观察到每个miR-29成员转染后p-Rb水平降低，而总Rb水平不变（图3f）。内源性CCND2的敲除可以“观察”miR-29对NB4和THP-1中Rb磷酸化的功能（图3g）。我们接下来使用流式细胞术检测miR-29模拟物和CCND2 siRNAs处理的NB4和THP-1细胞中的DNA环境，并观察到miR-29模拟物（图3h）和CCND2 siRNA（补充图S5）抑制G1 S过渡在这些细胞。这些数据表明miR-29可通过调节Akt通路和p-Rb水平抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。

MiR-29a / b / c表达与PBMNC样品中的Akt2和CCND2表达呈负相关。为了进一步阐明miR-29家族与Akt2 / CCND2表达在初级样本中的关系，我们首先检测了来自20例新诊断的AML患者和23例健康对照的PBMNC样本中的Akt2和CCND2，并观察到显着增加的Akt2和CCND2蛋白表达 在AML患者（图4a，b和补充图S6）中。然而，在相同AML样品中检测到明显下调的miR-29a，-29b和-29c的表达水平（图4c）。散点图和Pearson相关分析进一步表明，miR-29a / b / c表达与PBMNC样品中的靶蛋白水平呈负相关（图4d，e）。这些数据表明，降低的miR-29s表达与大多数AML患者的Akt2和CCND2水平升高有关。

由c-Myc，miR-29家族和Akt2组成的反馈回路参与骨髓白血病发生。据报道，c-Myc负调控miR-29aB29b-1和miR-29b-2B29c簇在转录水平上的表达。因此，我们推断AML病例中miR-29家族水平的降低可能来自放松管制的c-Myc表达。如预期的那样，在去除THP1细胞中的内源性c-Myc表达后，成熟miR-29a，-29b和-29c的水平升高（图5a）。相应地，Akt2和CCND2的蛋白质水平降低（图5b）。相反，c-Myc的过表达抑制miR-29家族表达，（图5c），其导致Akt2和CCND2蛋白表达增加（图5d）。这些结果证明c-Myc诱导的miR-29下调导致两种靶蛋白的增加。有趣的是，据报道，c-Myc是PI3K / AKT途径的下游受体之一。为了检测Akt2是否可以通过调节c-Myc影响miR-29的表达，我们用AKT2特异性siRNA转染了THP-1和NB4细胞，发现AKT2的降低导致了c-Myc表达的降低， 增加miR-29s表达（图5e和f）。反过来，Akt2上调c-Myc表达（图5g），进一步抑制了THP-1细胞中miR-29家族的表达（图5h）。然后我们检测到已被证明具有明显高的Akt2表达的AML患者中c-Myc的表达（参见图4），并观察到这些AML病例中c-Myc蛋白也被上调（图5i和补充图S7）。这些结果表明，包含c-Myc，miR-29家族和Akt2的反馈回路参与骨髓白血病发生。每个miR-29成员的重新引入可以部分纠正AML BM细胞中异常细胞增殖和凋亡抑制和骨髓分化停滞。为了检查AML细胞中miR-29成员的功能，我们首先分析了来自五个健康供体和20个主要诊断的AML患者的BM CD34 细胞中miR-29的表达，并检测到AML中所有三种miRNA的表达显着降低 BM CD34 细胞（图6a和补充表1）。然后分别用表达miR-29a，-29b，-29c和GFP的重组病毒感染来自三个AML患者（第6号，第M4号，第1号，第M2号和第11号M5）的BM CD34 细胞。通过实时PCR确定感染效果，收集GFP阳性细胞进行分析。 在第3,5,7和9天检测细胞的增殖活性，感染后第5天测定细胞凋亡早期和晚期细胞百分比。结果表明，每个miR-29成员的过表达抑制细胞增殖（图6b）并诱导细胞凋亡（图6c）在AML细胞中。此外，每个miR-29成员的重新引入抑制AML细胞中的Akt2和CCND2表达（图6d），这进一步证实miR-29成员至少部分通过抑制Akt2和CCND2表达参与调节细胞增殖和细胞凋亡。对于粒细胞和单核细胞分化和miR-29a重新引入到AML中，miR-29a的细胞可以克服分化阻滞，我们检查了miR-29b和miR-29c是否具有与miR-29a相同的作用。在病毒感染来自第6号，第1号和第11号的BM CD34 细胞后，细胞同时或单独诱导为单核细胞和粒细胞分化。通过流式细胞术检测髓系分化标志物（CD11b和CD14）和May-Gruuml;nwaldGiemsa染色，我们观察到，与miR-29a一致，AML CD34 细胞中miR-29b

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