遗传变异体降低了MTR基因的表达增加了汉族人患先天性心脏病的风险外文翻译资料

 2022-11-15 15:04:39

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遗传变异体降低了MTR基因的表达增加了汉族人患先天性心脏病的风险

目的：较高的同型半胱氨酸水平被认为是患先天性心脏病的一个重要因素，但在此效应下的机制却仍然未知。在早期胚胎发育过程中，同型半胱氨酸的去除完全由MTR活性决定。为了研究MTR在患CHD风险中的作用，我们确定了MTR的遗传变异体并调查其影响自身表达水平和增加中国人群患CHD风险的机制。

方法与结果：在包含2340例CHD患者和2270例对照的三项独立病例对照中检查了MTR基因和CHD的调节变体之间的关联，两种MTR的调节变体（-186Tgt;G和 905gt;A）在单独和组合的病例对照研究均与CHD风险上升有关联。与主要等位基因相比，-186G等位基因显着降低启动子活性，降低hnRNA和mRNA水平，降低转录因子结合亲和力，并且高度甲基化的启动子。 905Ggt;A等位基因对下调MTR表达的功能微小表现出统计学上更强的结合亲和力。在翻译层面，两种等位基因与血浆半胱氨酸浓度升高相关，表明高同型半胱氨酸血症的遗传成分。

结论：MTR基因的调节变异体通过降低MTR表达并诱导同型半胱氨酸积累和升高来增加患CHD的风险。

关键词：先天性心脏病 甲硫氨酸合成酶 同型半胱氨酸

介绍

先天性心脏病（CHD）是最常见的疾病之一，导致出生缺陷，也是全球婴儿死亡的主要原因之一。在过去几十年间，一系列临床研究表明，概念性叶酸补充剂可预防CHD。在孕妇或发育胚胎中叶酸的缺乏可能潜在的导致CHD。因此，参与叶酸代谢途径的核心基因已被视为CHD风险增加的候选因素。迄今为止，CHD已经与叶酸代谢基因的常见变体相关联，例如MTHFR c.677Cgt;T和c.1298Agt;C，尽管这些结果偶尔会出现冲突。这些矛盾意味着许多已发表的关联研究中的叶酸变体不能令人满意解释叶酸代谢与CHD风险之间的关系。甲硫氨酸合成酶（MTR，EC2.1.1.13）是其中的关键叶酸代谢中的酶，催化甲基转移组从5-甲基四氢叶酸转移到高半胱氨酸去除同型半胱氨酸。有几项研究表明，欠缺MTR酶会导致叶酸缺乏相关的出生缺陷。纯合子的MTR敲除小鼠是胚胎致死的，这表明MTR活动对早期胚胎发育至关重要。由于早期胚胎缺乏补偿途径的活动开发，同型半胱氨酸的去除是专有的对胚胎中的MTR活性影响的因素在我们以前的研究中，我们确定了一个甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）的变体用于激活MTR酶，这显着相关汉族人口的风险增加。此后，假设可遗传的胎儿携带遗传缺陷的MTR变种容易受到母体叶酸不足的挑战。 为了测试这个假设，我们进行了调查MTR的遗传变异体在CHD风险中的作用和这些作用的基础的机制。

材料与方法

材料和方法可以在线补充资料和附录中找到。

结果

非编码MTR变体-186Tgt; G而 905Ggt; A是独立的与先天性心脏病有关。

MTR非编码区的四种遗传变异，所有等位基因频率均低于0.1，通过测序鉴定：

-186Tgt;G（rs28372871）在启动子和 112Agt;C（rs2853522）， 905Ggt;A（rs1131450）和 1684C.T（rs1804742）3UTR。 这些变体与CHD风险的关联随后在中国人群中进行了探索（见补充材料，表S1）。在上海602例CHD患者和660例患者匹配对照，与纯合野生型相比纯合GG基因型-186Tgt;G单核苷酸多态性（SNP）在MTR基因启动子中有明显的增加，CHD的风险（OR = 1.56，P = 0.0026）。与纯合野生型相比SNP 905Ggt;A的纯合AA基因型MTR基因的3UTR也显着相关，CHD的风险增加。(OR =3.56, P= 8.29 times; 10-6)。在山东包含735例CHD患者564例正常对照的研究中，CHD风险同样升高。与野生纯合子类型相比观察到-186Tgt;G SNP（OR = 1.53，P = 0.0011）和 905Ggt;ASNP（OR = 2.13，P = 0.0045）。在第三项江苏包含1003例CHD患者与1046例正常对照的研究中同样观察到与野生纯合子相比，-186Tgt;G SNP (OR =1.61, P =0.0002) 和 905Ggt;A SNP (OR = 2.81,P = 3.03 times; 1028)与患CHD风险显著增加有关联（见表1）。其他两种SNPs(rs2853522 和 rs1804742)与患CHD的风险无关联（见补充材料在线，表S2）。其他广泛报道叶酸代谢基因的多态性途径，包括MTHFR c.677Cgt;T和c.1298Agt;C，MTRc.2756Agt;G和MTRR c.66Agt;G，也在我们的基因型样本，只有纯合子MTHFR c.1298CC基因型名义上与CHD的风险增加有关（见补充材料在线，表S3）。三项独立病例对照结果一致。三项独立研究的结合显示，与纯合野生型相比，有1.56倍与MTR-186GG基因型相关的CHD风险增加(P = 1.32times;10-9），有2.74倍与 905AA基因型相关的CHD风险增加（P = 6.35times;10-14），总样本量为2340CHD患者和2270例对照（表1）。为了解决多次统计测试造成的问题，我们采用了Bonferroni校正。给出四个显着性水平调整为P = 0.0025在五个遗传模型下测试SNP。在三组或整体组中，-186Tgt;G和 905Ggt;A SNPs都总体上与增加CHD风险显著相关，除了上海组-186Tgt;G SNP（P=0.0026）和山东组 905Ggt;A SNP（P=0.0045）。三个队列的荟萃分析揭示了MTR-186GG基因型(95%CI=1.34–1.70)增加了1.51被CHD风险， 905AA基因型(95%CI= 2.10–3.53)增加了2.73被CHD风险（表2）。单体型分析显示MTR最重要的风险影响单倍型-186G / 905A（P = 2.4times;10-12）（见附录材料在线，表S4）。累积效应分析显示两个位点易感等位基因的携带者表现较高在单一地点做携带者的风险（见补充材料在线，表S5）。 纯合突变体等位基因的载体两个地区的CHD风险都高出3.04倍纯合野生型（P = 1.04times;10-9）。MTR变体与MTRR c.56 781A.C之间的相互作用被评估，因为两个研究是在同一个进行队列。在逻辑回归分析中，MTR 905Ggt;A展示与MTRC.56 781Agt;C的名义上显着的互动在隐性模型下（P = 0.02）。与野生杂合子相比，组合基因型MTR 905AA和MTRRc.56 781CC是风险基因型。根据分类进行分层分析和孤立的CHD表型。 统计最高在分期缺陷中观察到意义（-186Tgt;G：P = 2.55times;10-8; 905Ggt;A：P = 9.48times;10-12）。 另外，对于CHD的亚组，我们观察到MTR变体与室间隔缺损明显相关（-186Tgt;G：P = 6.79times;10-8; 905Ggt;A：P = 5.48times;10-12）（见补充材料在线，表S6）。

变异体-186Tgt;G在MTR转录活性的功能重要性

为了评估变体-186Tgt;G对MTR转录活性功能的影响，在28个心血管组织样品中的-186Tgt;G变体的不同基因型中，我们进行体外荧光素酶启动子测定并比较体内hnRNA和mRNA水平。

表1 在三项独立病例对照研究中，MTR非编码区的变异体-186Tgt; G和 905Ggt; A与CHD之间的关联

表2 荟萃分析MTR变体和先天性心脏病风险组合样本组的结果

荧光素酶测定显示启动子次要G等位基因与主要T等位基因相比，含有质粒的活性显着降低了40％（图1A）。实时定量聚合酶链反应（PCR）结果显示与主要T等位基因相比，在含有次要G等位基因的组织样品hnRNA和mRNA两者的数量显着降低中（图1B）。体外和在体内研究结果表明携带MTR 2186G等位基因的胎儿可能由于减少MTR表达而面临更大的风险。

-186Tgt; G MTR变体衰减转录因子结合亲和力

变体-186Tgt;G的功能后果可能是其对转录因子结合亲和力的影响的结果，这种结果可能导致转录水平的改变。 两种电泳迁移率转移分析和实时表面等离子体共振（SPR）分析透露，与主要的T等位基因探针相比，未成年人G等位基因寡核苷酸探针对核具有较低的结合亲和力

来自HEK-293细胞的蛋白质（参见在线补充材料，图S1A-C）。计算分析预测，USF转录因子

具有以-186Tgt;G SNP为中心的结合基序（见补充材料在线，图S2）。这个因素的约束力是

通过使用纯化的USF-2蛋白质的直接SPR测定来定义。该-186T等位基因探针对USF-2的结合亲和力高于-186G等位基因探针的结合亲和力10倍（见补充材料在线，图S1B）。使用HEK-293细胞或心血管组织样品的染色质免疫沉淀测定表明，MTR启动子的2186位置被USF-1/2占据在体内，-186G等位基因的转录水平显着低于-186T等位基因的转录水平（图1C和D，参见在线补充资料，图S1D和E）。使用USF-2的过表达研究证实USF作为MTR转录激活子的作用。 USF-2的过度表达通常增加了MTR转录，但扩增了-186等位基因表达差异（图1E）。 这些数据支持USF可以通过降低G等位基因启动子的转录活性来对MTR表达发挥等位基因特异性影响的假设，USF具有减弱的结合亲和力。

-186Tgt; G启动子的甲基化调节MTR表达

使用5-氮杂-20-脱氧胞苷在HEK-293细胞中DNA甲基化被阻断后，MTRhnRNA和mRNA水平增加（见在线补充资料，图S3）。为了探讨MTR表达是否受到-186Tgt;G甲基化的影响SNP等位基因特异性启动子，我们使用28个心血管组织样本分析了位置-186附近的22个潜在甲基化位点（图2A）。当甲基化程度增加时，MTR表达降低，与-186Tgt;G SNP无关（图2B）。 与T等位基因相比，-186G等位基因与MTR启动子中CpG位点的甲基化显着升高相关（3.88对1.21％，Plt;0.0001）（图2C-E）。变体-186Tgt;G中的次要G等位基因和甲基化启动子分别与MTR表达降低有关; 然而，具有次要G等位基因的启动子总是与广泛的甲基化相关;因此，遗传和表观遗传学作用可能有助于观察到MTR表达的降低。

与 905Ggt; A变异体相关的微小RNA及其对MTR表达的调控相关的鉴定

905Ggt;A变体位于MTR的3UTR中的预测的微小RNA结合区域。为了探讨这种变异是否影响基因表达，我们将携带G或A等位基因的 905Ggt;A周围的878bp序列克隆到萤光素酶报道载体psiCHECK-2的3UTR中。在这些转染实验中，与携带HEK-293细胞中主要G等位基因的携带次要A等位基因的质粒构建体相比，荧光素酶活性降低21％。HCM细胞减少36％，H9C2细胞减少15％（图3A）。总共14个微RNA预测调节MTR表达：7个结合上游序列，2个结合到下游序列，和5个结合含有 905Ggt;A变体的序列（图3B）。 在H9C2细胞中共同转染psiCHECK-G / A质粒和微小RNA表达载体显示，14种预测的微小RNA中只有3种显着改变了报告基因的表达。

这些microRNAs是miR-485，miR-608和miR-1293（图3C）。 实验功能的微小RNA进一步扩增了 905Ggt;A等位基因变体观察到的MTR表达差异。 此外，三种功能性微小RNA在所有28种人类心血管组织样品中普遍表达（图4A）。

候选microRNA的功能验证

在所有转染的细胞系中，psiCHECK-G和psiCHECK-A的荧光素酶表达以逐渐浓度的每个单独的微RNA以线性方式被抑制，并且对于 905A等位基因而言，该效应更明显（图4B）

图1 MTR 2186T.Gvariant在转录水平下调MTR表达。所示的数据表示为平均值plusmn;SE（样本平均值的标准误差）。 （A）与不同细胞类型的主要T构建体相比，次要G等位基因构建体中的荧光素酶表达显着降低（HEK中为43％，HCM为293,49％，H9C2细胞为50％）。每个实验用三份培养物进行三次。 （B）具有不同2186T.G基因型的28个心血管组织样品中MTR体内hnRNA和mRNA水平的定量实时聚合酶链反应分析。 （C）使用HEK-293细胞和心血管组织样品的染色质免疫沉淀测定。使用聚合酶链反应证实USF1 / 2结合MTR启动子的存在。 （D）使用来自CHIP输入的SNaPshot对两个等位基因的量进行定量，并用USF-1/2抗体处理产物。 -186T等位基因的转录水平显着高于-186G等位基因水平。 （E）含有T或G等位基因的荧光素酶构建体用pcDNA3.1（对照）或pcDNA3.1-USF-2表达质粒共转染。

通过添加特异性抑制剂，等位基因表达差异减弱的单个或一起的每个功能微小RNA（图4C）.SNP 905Ggt;A发生在miR-608和miR-1293的互补结合序列中。 如所预测的那样，直接SPR测定表明 905A等位基因比 905G等位基因更强地结合miR-608和miR-1293。这种作用将导致mRNA稳定性降低或被抑制的翻译（参见在线补充材料，图S4）。关于上游miR-485，存在的SNP 905Ggt;A可能影响它们与RNA与microRNA复合物之间的结合亲和力，如 我们也证实这些microRNA仅在翻译水平上调节MTR表达（见在线补充资料，图S5）。

-186Tgt; G和 905Ggt; A SNP对人血浆高半胱氨酸浓度的影响

为了揭示影响MTR

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