DNMT3A基因启动子中的rs1550117 A> G变体显着增加了汉族人群的非小细胞肺癌易感性外文翻译资料

 2022-11-15 15:18:08

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DNMT3A基因启动子中的rs1550117 Agt; G变体显着增加了汉族人群的非小细胞肺癌易感性

摘要

在本研究中，我们进行了病例对照研究，以探讨汉族人群中DNMT3A基因启动子rs1550117 Agt; G变体与非小细胞肺癌（NSCLC）易感性之间的关系。通过聚合酶链反应 - 限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）进行rs1550117Agt; G变体的基因分型，并通过测序证实。 rs1550117等位基因G与非小细胞肺癌的风险增加有关。此外，携带GG基因型的个体具有比AA和GA基因型携带者更高的发展NSCLC的风险。进一步分层分析显示，rs1550117 Agt; G与年龄（gt; 60岁），性别（男性），吸烟和饮酒显着相关。体内检测NSCLC组织中的DNMT3A mRNA水平和体外荧光素酶测定一致地显示等位基因G显着降低DNMT3A转录。另外功能的分析显示与rs1550117的等位基因G相关的转录阻遏物SP1的增加的结合亲和力导致DNMT3A的显着降低的表达。总之，我们的研究结果提出DNMT3A在NSCLC发展中的抑制作用，并强调DNMT3A在肿瘤发生中的双重作用。

介绍

肺癌已经是中国多年诊断和癌症死亡的主要癌症，特别是在湖北省发病率高，死亡率高[1,2]。非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的肺癌，占80％〜90％[3]。 目前，手术切除术已经成为早期肺癌患者的有效治疗方法[2]。 不幸的是，大多数肺部患者在IIIB / IV期才被诊出，到了这一时期，肿瘤不可再切除。 鉴于此，迫切需要发现风险预测和肺癌早期诊断的新方法。

DNA甲基化是最明显的表观遗传修饰之一，在癌症发展中具有重要作用[4]。 值得注意的是，在大多数人类癌症中已经发现异常DNA甲基化模式，包括NSCLC [5]。 作为从头开始的DNA甲基转移酶，DNMT3A有助于建立基因组DNA甲基化模式[6]，表明异常的DNMT3A表达可能导致致癌过程中的异常DNA甲基化。另一方面，基因的5和3-UTR（非翻译区）中的某些遗传变异最近被证明影响启动子活性（基因表达）和信使RNA（mRNA）构象（稳定性）[7]。因此，鉴定DNMT3A基因的功能变异和分析其作用可能会更好地了解其对DNMT3A基因表达和个体对癌症易感性的影响。

最近，一些研究调查了DNMT3A变体与癌症风险之间的关联[8-15]，并提出了DNMT3A基因启动子转录起始位点上游448bp的推定功能变体（rs1550117）[10]。 然而，以前研究的结果仍然是矛盾的而不是决定性的[16,17]。 这种差异可能主要归因于样本量和样本人数不同。 此外，据我们所知，DNMT3A rs1550117与NSCLC易感性的关联尚未阐明。 为了解决这些问题，进行病例对照研究，以估计样本量较大的湖北汉族人群DNMT3A rs1550117 Agt; G变异与NSCLC风险之间的关系。

结果

研究对象的特点

年龄，性别，吸烟状况和酒精状况的分布在NSCLC患者和正常对照组之间没有显着差异，表明基于这四个变量的匹配是足够的（表1）。此外，NSCLC患者和正常对照组具有相似的平均分布 年龄：60.1岁（范围：23〜81岁）和58.6岁（范围：27〜85岁）。

DNMT3A rs1550117 Agt; G变体显着增加NSCLC的风险

rs1550117Agt; G变体的基因型频率与正常对照组中的Hardy-Weinberg平衡（HWE）一致（p = 0.537），表明入选对照受试者是代表性的。在表2中，NSCLC患者和正常对照组之间rs1550117的基因型分布差异有统计学意义（p = 0.001）。此外，NSCLC患者的G等位基因频率显着高于正常对照组（p = 0.001，OR = 1.36,95％CI = 1.18-1.71），表明等位基因G与NSCLC风险增加相关。类似地，我们还发现在三种遗传模型中，GG与GA（p = 0.010，OR = 1.33,95％CI = 1.06-1.71）的GG基因型和rC1550117Agt; G变体的GG基因型和NSCLC增加的风险之间的显着相关性，GG与AA（p = 0.032，OR = 1.95,95％CI = 1.03〜3.60），GG对GA AA（p = 0.002，OR = 1.39,95％CI = 1.15-1.80）。这些结果表明，DNMT3A 5调控变体rs1550117Agt; G显着增加NSCLC的风险。另外，NSCLC患者年龄le;60岁vsgt; 60岁（p基因型 = 0.768，p基因型 = 0.603），男性与女性（p基因型 = 0.656，p基因型 = 0.607）之间无差异的DNMT3A rs1550117，吸烟与非吸烟（p基因型= 0.347，p等位基因= 0.224），饮酒与非饮酒（p基因型 = 0.482，p等位基因 = 0.811）（表3）。

rs1550117Agt; G变异体对NSCLC的敏感性与年龄（gt; 60岁），男性，吸烟和饮酒密切相关

年龄，性别，吸烟和饮酒被认为是肺癌发生的重要因素[1,2]。 在本研究中，根据年龄，性别，吸烟状态和酒精状态进行了rs1550117的分层分析。 结果表明，这些因素将影响rs1550117 Agt; G变异与NSCLC风险之间的关联。 具体来说，携带G等位基因和GG基因型的个体与gt; 60岁男性，吸烟和饮酒亚群中携带A等位基因和GA / AA基因型的个体相比，NSCLC风险显着升高，而不是le;60岁，女性，非吸烟者 和非饮酒亚组（表4）。 此外，所有基因型频率与每个亚组正常对照组中的HWE一致（pgt; 0.05）。 这些结果表明，rs1550117 Agt; G变体对非小细胞肺癌的风险增加，特别是超过60岁的吸烟男性和饮酒情况。

rs1550117 Agt; G变体降低NSCLC中的DNMT3A转录活性

虽然以前的研究表明rs1550117 Agt; G变体影响中国仓鼠卵巢细胞中DNMT3A启动子的转录活性[10]，但是有人想知道这种潜在的机制是否也适用于NSCLC。我们进行了双重荧光素酶测定，发现含有G等位基因的质粒显示比A等位基因显着降低的荧光素酶活性，A549细胞减少48％，PC14细胞减少45％，Hek293细胞减少50％（图1A）。最近鉴定出一种新的短型同种型DNMT3A2蛋白（约82kDa）。该同种型的转录起始于DNMT3A基因的第六内含子中的不同启动子，其编码全长同种型-DNMT3A蛋白（约120kDa）。因此，DNMT3A基因启动子中的rs1550117Agt; G变体可能特异性地负责DNMT3A而不是DNMT3A2的表达。在这项研究中，还测试了56个不同rs1550117 Agt; G基因型的NSCLC组织样本中的DNMT3A mRNA水平，并且在GA样品（1.6倍）和AA样品（3.1倍）中，DNMT3A在GG样品中显着上调（3.1倍） 1B）。这些结果一致地表明rs1550117Agt; G变体降低NSCLC中的DNMT3A转录活性。

rs1550117 Agt; G变体增加了转录抑制子SP1结合亲和力

使用阿里巴巴软件来预测rs1550117 Agt; G变体会产生SP1和GR的转录因子（TF）结合位点。然而，染色质免疫沉淀（ChIP）测序导致ChIPBase v2.0数据库（http://rna.sysu.edu.cn/chipbase/）和以前的调查结果集体表明SP1而不是GR可以绑定到DNMT3A启动子区[18,19]。在本研究中，通过ChIP测定，证明具有-448位点的DNMT3A启动子片段被SP1占据（图2B）。此外，表面等离子体共振（SPR）分析显示，与A等位基因寡核苷酸探针相比，G等位基因寡核苷酸探针对Hek293核蛋白或纯化的重组SP1蛋白具有较高的结合亲和力（图2C）。共转染实验显示异位SP1表达通常降低含有DNMT3A rs1550117A等位基因或G等位基因的质粒的荧光素酶活性，并且rs1550117变体扩增启动子功能差异（图2D）。总之，SP1作为DNMT3A基因的转录阻遏物，并且rs1550117Agt; G增加SP1对DNMT3A启动子的结合亲和力，最终有助于降低DNMT3A的表达。

讨论

以前证实DNMT3A促进肿瘤发生[20]。 然而，潜在的分子机制仍然难以捉摸。 一种可能性是过表达的DNMT3A可能导致某些肿瘤抑制基因（TSG）在肿瘤发生中的沉默。 实际上，显示DNMT3A的敲低将提高黑素瘤中一些免疫应答基因的表达[21]。 类似地，DNMT3A的消耗恢复了参与肝细胞癌（HCC）的细胞周期调节，转录调节和信号转导的各种TSG（包括PTEN）的表达[22]。

另一方面，许多遗传关联研究调查了胃癌，尿路上皮癌，食管癌，卵巢癌，乳腺癌，结肠直肠癌和肝细胞癌中DNMT3A rs1550117 Agt; G变体与癌症风险之间的关系，但结果不一致[8-15]。 鉴于此有人进行了全面的分析，发现rs1550117A等位基因显着增加了癌症的风险[16]。 有趣的问题是为什么rs1550117变体可能影响个体对癌症的易感性。在本研究中，首先揭示了SP1作为DNMT3A基因的转录阻遏物，SP1对r等位基因具有比等位基因rs1550117 G更高的结合亲和力。 因此，与G等位基因相比，rs1550117A等位基因将降低SP1结合亲和力，从而导致DNMT3A的表达增加，最终增加了癌症的易感性。

尽管这些证据在肿瘤发生中明确赋予DNMT3A的致癌作用，但最近发现的急性骨髓性白血病（AML）中的DNMT3A突变表明其在癌症中的作用比以前认为的更复杂[23-27]。进一步的功能分析表明，DNMT3A突变将影响全球DNA甲基化模式和HOXA基因的表达[28]，其在AML肿瘤发生中起重要作用[29]。此外，两篇最新的出版物显示，小鼠肺癌模型中的Dnmt3a缺失促进了肿瘤的发展，但不能引发[30,31]，而Dnmt3a维持特异性致癌基因的甲基化依赖性抑制（MDR），其涉及肺的关键步骤肿瘤进展，包括血管生成，细胞粘附和运动[30]。这些结果表明Dnmt3a可能是肿瘤抑制基因和肺肿瘤发生的关键决定因素[30]。然而，这里有一个问题，DNMT3A是否在人类肺癌中与小鼠肺癌模型中相同。

在本研究中，选择DNMT3A基因启动子中推定的功能性rs1550117Agt; G变体，以评估汉族人群中DNMT3A基因与NSCLC易感性之间的关系。有趣的是，我们发现携带rs1550117GG基因型的个体与个体相比显示出显着增加的NSCLC感受性 携带GA和AA基因型，表明G等位基因是rs1550117变体潜在表现的有害作用。 同时，GG基因型与NSCLC组织中DNMT3A mRNA表达下降，与GA和AA基因型相关。因此，DNMT3A可能参与人类NSCLC的抑制，与以往肺癌小鼠模型研究结果一致。

本研究结果首先表明，DNMT3A rs1550117 Agt; G变体与汉族人群NSCLC风险显着升高相关，同时首先揭示DNMT3A rs1550117 Agt; G变体通过增加结合亲和力降低DNMT3A表达 的转录抑制子SP1。 此外，分层分析表明，超过60岁的男性和女性吸烟对rs1550117 Agt; G更易患NSCLC。 我们的研究提出DNMT3A在抑制NSCLC发展中的意想不到的作用，并进一步强调DNMT3A在肿瘤发生中的双重作用。 这里报道的结果可能会启动预防和预防NSCLC的新策略。 然而，进一步的确认研究应该在其他种族人口进行，因为目前的观察只涉及汉族人口。

材料和方法

主题

本研究共招募了998例正常对照组和600例组织学证实的NSCLC患者。 所有科目均为湖北省汉族人士。 今天越来越多的中国人倾向于每年进行身体检查。 正常对照选自无锡市新州区人民医院进行年度体检或自愿参加流行病学调查的无癌患者。 要求在最近三年通过正常对照全年进行身体检查。 患者确诊为组织病理学，志愿者从同一医院招募。 本研究由武汉市新州区人民医院和武汉理工大学伦理委员会批准，书面知情同意遗传学分析获自所有科目或监护人。

DNMT3A rs1550117 Agt; G变种基因分型

将样品收集到含有乙二胺四乙酸（EDTA）的血液真空管中，并在4℃下储存。如前所述，通过蛋白酶K消化，在采集样品的1周内提取基因组DNA [32]。 DNMT3A rs1550117变体的Agt; G的转变产生TspRI限制性位点，使用PCR-RFLP检测在-448Agt; G（GenBank登录号NT_022184.14：g.4381840）的DNMT3A的启动子中的该AG转换。PCR反应总共含有50ng基因组DNA，1.5mu;l10times;Taq缓冲液（Mg2 Plus），0.2mu;l10mM dNTP，1mu;l1mM Primer（正向：5-ACACACCGCCCTCACCCCTT-3;反向5 -TCCAGCAATCCCTGCCCACA-3）和0.5U Taq聚合酶（Takara Biotechnology Co.Ltd。，大连，中国）。PCR循环条件由初始熔融步骤94℃5分钟，随后36个循环94℃30秒，63℃30秒，72℃3

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